一般人我不告诉的NanoDrop新应用——定量葡萄糖浓度

NanoDrop One/OneC超微量分光光度计

NanoDrop超微量分光光度计已经被生命科学领域用户使用了20多年，基于1到2μL的微量体积，即可进行核酸、蛋白等样品的浓度、纯度、污染物等分析和质控。除此之外，基于己糖激酶((Glucose HK)测定法，在NanoDrop One/OneC上面还能进行葡萄糖浓度的测定，这种自定义方法允许研究人员使用最少量的宝贵样品即可实现葡萄糖的浓度定量。

葡萄糖是许多生物体的主要能量来源。因此，定量葡萄糖浓度可以在各种科学研究中成为一个有用的工具，包括癌症研究和植物生物学。葡萄糖浓度的定量方法有很多[1];然而，用分光光度计准确、直接地定量葡萄糖浓度是很困难的。葡萄糖通常存在于含有核酸和蛋白质的样品中，这三种分子都吸收光谱中紫外线区的光。在目前的技术下，紫外可见光分光光度计无法区分同一波长下不同分子的吸光度，这给直接定量样品中的葡萄糖带来了挑战。

图1：自定义方法选择界面，用户上传方法到仪器并运行

本文描述了NanoDrop One/OneC分光光度计如何使用Sigma-Aldrich®葡萄糖(HK)测定试剂盒(产品编号GAHK-20)[2]定量葡萄糖浓度。该试剂盒通过葡萄糖与ATP和己糖激酶反应产生葡萄糖-6-磷酸，增加了测量的特异性。

该实验的最终产物是NADH，由葡萄糖-6-磷酸和NAD与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶反应时产生。图2显示了该反应如何确保生成的NADH浓度与葡萄糖的起始浓度相等。

图2：从葡萄糖中产生等摩尔的NADH

检测方法及结果

NanoDrop One/OneC葡萄糖己糖激酶定制方法在340 nm处测量吸光度，并在750 nm处进行基线校正。

NADH吸收340 nm的光，这里用该波长的吸光度来测定样品的葡萄糖浓度。NADH的一个示例谱如图3所示。

一旦获得340 nm吸光度，需要在NanoDrop One/OneC软件外进行计算以确定葡萄糖浓度。Microsoft®Excel®电子表格包含自定义方法下载，其中包含所需的方程。研究人员只需输入总分析体积、稀释系数、样品体积和340 nm吸光度的值。电子表格将计算每个样品的葡萄糖浓度。

图3：NADH光谱示例图。产生的NADH浓度相当于葡萄糖的起始浓度

为了评估NanoDrop One/OneC分光光度计上Sigma-Aldrich Glucose (HK) Assay测量结果的准确性，将所提供的1 mg/mL葡萄糖标准品稀释至0.05 mg/mL。样品与试剂的比例为1:100，每种浓度进行三次重复测量。结果显示，在0.25-1.0mg/mL之间，检测呈线性，R²值为0.9911。

图4：葡萄糖测定性能。用Sigma-Aldrich glucose (HK) Assay测定葡萄糖的稀释液。

本文说明NanoDrop One/OneC分光光度计可用于使用己糖激酶反应测量样品的葡萄糖浓度。

这里给出的数据验证了1:100样品与试剂比反应的线性范围。研究人员可以使用可下载的方法和电子表格来测量样本并分析数据。

自定义方法下载导航

1. 导航到www.thermofisher.com/nanodrop

2. 左侧选择“NanoDrop Software Download”

3. 选择“NanoDrop One/OneC”

4. 选择“Local Control Software Download Instructions”

5. 滚动到 “How to add a NanoDrop One/OneC Custom Method file” 然后点击 “Glucose HK Kit (NADH) Method”

6. 解压缩自定义方法文件并将方法文件复制到USB设备，然后按照“Instructions for uploading a Custom Method to the instrument from a USB device”进行操作。

参考文献

1. D. A. T. Southgate, Determination of food carbohydrates (Elsevier Applied Science; Elsevier Science Pub. [distributor], London; New York; New York, NY, USA, 1991).

2. Sigma-Aldrich, Glucose (HK) Assay Kit GAHK20 (available at https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/gahk20 accessed 30 Jan 2018)

• NanoDrop One/OneC，仅需1-2μL样品，5s内得出结果。内置Acclaro™智能样本检测技术，可以分析核酸中的蛋白质、苯酚、盐酸胍、胍盐等污染，自动计算并校正给出真实的核酸浓度。可选FDA  21 CFR Part11审计追踪软件，满足合规性要求。另外还支持蛋白浓度和和自定义检测等应用。

• 除了在NanoDrop One/OneC PC端控制软件上建立了自定义方法外，还可以从NanoDrop主页的软件部分下载定制的检测方法，现有叶绿素含量法、葡萄糖HK试剂盒（NADH）法、碳氧-血红蛋白、球形金纳米颗粒法等，可实现更广范的应用。

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基因有限公司自2004年成为NanoDrop Technologies公司（2007年被Thermo Fisher Scientific公司并购）在中国区的合作伙伴，至今已有近20年的合作历史，负责NanoDrop全系列产品线的售前咨询、售后安装、应用培训和维修维护等服务。目前在中国有数万台装机，服务了几十万用户。