当单细胞遇上空间技术：发现瘫痪患者重新行走的秘密

当两种技术强强联合来解决复杂生物学中的“what”和“where”问题时，会发生什么？我们在“当单细胞遇上空间技术”系列文章中分享了这些故事，重点介绍了充分利用这两种技术优势的研究，体现了它们联用后如何发挥更大的作用。

为什么电刺激可以恢复瘫痪患者的行走能力？

2006年，Rob Summers刚刚在世界大学生棒球联赛中获胜，就在自家车道上被一名醉酒的司机撞倒(1)。医生告诉这位当时只有20岁的年轻人，他从胸部以下瘫痪，永远无法行走，无法控制大小便，也无法恢复性功能。

可是，他们错了。

三年后，Summers成为第一个参加路易斯维尔大学实验性硬膜外电刺激（EES）项目的人，该项目旨在治疗脊髓损伤的患者(2)。一组临床研究人员在他的硬膜上植入了一块16个电极的阵列，用它对脊柱下部进行电刺激——就像大脑在发起运动时所做的那样。经过近30次四小时的运动训练并配合EES，Summers可以自行站立近5分钟，在接受EES时可以依靠帮助在跑步机上行走(3)。

2008年，研究人员在《The Lancet》（柳叶刀）杂志上发表了他们的结果，当时他们持谨慎的乐观态度。文章第一作者Susan Harkema博士在与论文同日发布的新闻稿中表示：“这是一个突破。它为改善这些个体的日常功能打开了一个巨大的机会，但我们还有很长的路要走。”(4)

到了2018年，这条路变得短了一些。路易斯维尔大学的临床试验仍在继续，后来又有三名患者参加。研究团队在《New England Journal of Medicine》（新英格兰医学杂志）上报告称，经过强化刺激和运动训练，所有四名患者都能自行站立，其中两名患者在接受EES时可以借助助行器或拐杖行走(5)。其他团队在那一年也报告了类似的结果，包括来自瑞士联邦理工学院的一组研究人员(6-7)。

2022年11月，瑞士联邦理工学院的同一批研究人员将这项研究进一步推向了临床，他们报告了地面运动刺激（STIMO）的临床试验结果。研究人员在《Nature》杂志上报告称，经过五个月的训练，九名腿部没有知觉的患者可以在接受EES时行走(8)。最值得注意的是，其中四名患者甚至在关闭EES后仍能行走，这表明物理治疗与硬膜外电刺激相结合可以在某种程度上永久性重新连接脊髓中的神经元。

最初的测试结果显示，受伤部位附近的神经活动减少，但研究人员对此并不感到惊讶。瑞士联邦理工学院的Grégoire Courtine博士表示：“当你在学习一项任务时，情况正如你所看到的——随着你逐渐掌握它，激活的神经元也越来越少。”他是这项新发表的《Nature》研究的通讯作者(9)。

这正是他们所发现的。为了在动物模型中重现他们的研究，他们检查了小鼠的脊髓损伤，并进行EES。后腿瘫痪的小鼠在接受刺激后，其脊柱受伤部位的神经活动也受到抑制。但研究人员发现，一组特定的神经元足以让瘫痪小鼠运动，而野生型小鼠在运动时不需要这些神经元。

一份综合Chromium单细胞基因表达和Visium空间基因表达的力量绘制出的小鼠恢复中脊髓的单细胞图谱，引导他们找到了这个潜在的瘫痪治疗靶点。

定义和绘制恢复中脊髓内的神经元

研究人员首先使用单细胞核RNA测序（snRNA-seq）来分析带有/不带有脊髓损伤的小鼠的脊髓组织，部分小鼠接受了EES。他们分析了不同实验条件下24只小鼠的80,000多个细胞核，并通过无监督聚类鉴定出所有预期的主要脊髓细胞类型。他们将研究重点放在数据集中的20,990个神经元细胞核上，并发现了36个神经元亚群，这些亚群显示了特定类型神经元的清晰分离，特别是腹侧和背侧（图1）。

图1. 小鼠恢复中脊髓的细胞图谱。20,990个细胞核的UMAP可视化揭示了36个神经元亚群。根据标志物基因突出显示了五个背侧和腹侧的群体。在每个角落，根据经典标志物基因的表达而着色的UMAP可视化显示了背腹轴和兴奋-抑制轴的神经元亚群的基本结构。MN，运动神经元；VI，腹侧抑制性；VE，腹侧兴奋性；CSF-N，接触脑脊液的神经元；Ia-IN，Ia抑制性中间神经元；Rora-I，表达Rora的抑制性神经元；Rorb-I，表达Rorb的抑制性神经元。图片来源：Kathe C, et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature 611: 540–547 (2022) (8), (CC BY 4.0)

支配运动的电信号从背侧神经元流入，从腹侧神经元流出，刺激肌肉。这些特定神经元在脊髓中有着独特的解剖学排布，这就引发了关于它们的定位及细胞间相互作用的问题，而这些问题仅靠snRNA-seq无法回答。

于是，研究人员使用Visium空间基因表达技术，绘制了脊髓中的神经元。他们对61张切片进行了测序，每个条形码有16,000多个UMI，最终绘制了脊髓内的22,127个条形码。他们定位了snRNA-seq鉴定出的36个神经元群体，证实表达腹侧标志物（如Essrg）的细胞位于脊髓切片的底部，而表达背侧标志物（如Ebf1）的细胞则位于顶部。

“这种空间分辨的腰部脊髓单细胞图谱确立了一种分子制图，有助于定位在瘫痪后帮助恢复行走的未知神经元群体，从而确定与恢复相关的神经元，”作者写道。

研究人员还开发出一种名为Augur的算法，“识别那些在应对生物扰动时在转录上更容易区分的细胞类型”。他们将这种算法应用在脊髓损伤后接受EES治疗的小鼠身上，发现了整个恢复轨迹中增加的细胞群的转录特征。两个表达Vsx2和Hoxa10的兴奋性中间神经元群体在恢复期间有所增加，它们将信号从感觉神经元传递给运动神经元。

他们还创建了另一种名为Magellan的算法，它采用空间最近邻框架来关注空间扰动后转录发生变化的组织区域。他们将具有已知转录影响的扰动应用在模拟数据集上，并在分析后验证了这种方法。Magellan鉴定出的神经元群体与Augur相同。

当科学家采用光遗传学方法让表达Vsx2和Hoxa10的细胞失活时，从脊髓损伤中恢复的小鼠又丧失了行走能力。不过，这些细胞的失活对脊髓未损伤的小鼠没有影响，表明这一神经元群体只是对损伤后的运动至关重要。

瑞士联邦理工学院的博士后研究员、这项研究的共同作者Jordan Squair博士告诉《大众科学》，小鼠的脊柱正变得“更加高效”。受伤部位的神经元活动较少，但脊髓中的一小部分神经元得到了激活。

治疗瘫痪的下一步

其他没有参与这项研究的神经科学家则对这项研究的结果持谨慎的乐观态度，包括加州大学欧文分校的神经外科医师Michael Oh医学博士。“让人们离开轮椅并独立行走，这是一个奇迹，”Oh告诉《大众科学》(2)。

未来，研究人员可以通过专门刺激或激活Vsx2和Hoxa10阳性的神经元来改善与脊髓损伤相关的瘫痪。索尔克生物研究所的神经科学家Eiman Azim博士在一篇随附的评论文章中写道，电刺激技术目前还不能胜任这种特定的激活任务，但他很高兴看到这项技术及其应用的不断改进(10)。

不过Oh指出，这项研究鉴定出治疗的一个推定细胞靶点，但它并没有提供详细的机制(2)。此外，这些发现在人类身上是否成立，目前还不清楚。Azim表示，他持乐观态度，因为脊椎动物之间的脊柱结构是相似的(10)。

Courtine正准备将这些令人难以置信的单细胞和空间见解提升到新的水平。他建立了一家名为ONWARD的创业公司，计划将本研究所用的EES技术商业化。他的团队还在继续进行他们的小型临床试验STIMO，其中包含《Nature》研究中的9名患者，同时计划2024年在美国招募脊髓损伤患者进行更大规模的临床试验(11)。

我们不仅期待这项激动人心的研究带来的成果，还期待看到研究人员继续在小鼠、非人类灵长类动物和人类中使用单细胞和空间转录组学来描绘瘫痪和康复的分子基础。

点击阅读原文，您可深入了解这项研究，关于单细胞和空间转录组学联合的更多例子，欢迎阅读同系列文章“当单细胞遇上空间技术：新的肺部免疫生态位为抗体提供了长期的藏身之处”。

本文基于如下10x博客生成：

https://www.10xgenomics.com/cn/blog/when-single-cell-meets-spatial-researchers-uncover-how-people-with-paralysis-may-walk-again

参考资料：

1.Boyle R. With Electrical Stimulation to the Spinal Cord, Paralyzed Man Walks Again.Popular Science (2011). URL: https://www.popsci.com/science/article/2011-05/electrical-stimulation-spinal-cord-paralyzed-man-walks-again/

2.Guarino B. The slow, but promising progress of electrode therapy for paralysis.Popular Science (2022). URL: https://www.popsci.com/health/paralysis-electrode-therapy-success/

3.Harkema S. Effect of epidural stimulation of the lumbosacral spinal cord on voluntary movement, standing, and assisted stepping after motor complete paraplegia: a case study.The Lancet 377: P1938–1947 (2011). doi: 10.1016/S0140-6736(11)60547-3

4.https://www.prnewswire.com/news-releases/paraplegic-man-stands-steps-with-assistance-and-moves-his-legs-voluntarily-122259918.html

5.Angeli CA, et al. Recovery of over-ground walking after chronic motor complete spinal cord injury. N Engl J Med 379: 244–1250 (2018). doi: 10.1056/NEJMoa1803588

6.Gill M L, et al. Neuromodulation of lumbosacral spinal networks enables independent stepping after complete paraplegia.Nat Med 24: 1677–1682 (2018). doi:  10.1038/s41591-018-0175-7

7.Wagner FB, et al. Targeted neurotechnology restores walking in humans with spinal cord injury.Nature 563: 65–71 (2018). doi: 10.1038/s41586-018-0649-2

8.Kathe C, et al. The neurons that restore walking after paralysis.Nature 611: 540–547 (2022). doi: 10.1038/s41586-022-05385-7

9.Lewis D, et al. Electrical stimulation helps paralysed people walk again—and now we know why.Nature 611: 438 (2022). doi: 10.1038/d41586-022-03605-8

10.Huang KW and Azim E. Neurons that promote recovery from paralysis identified.Nature (2022). URL: https://www.nature.com/articles/d41586-022-02234-5

11.Heidt A. Scientists Identify Neurons Needed to Walk After Paralysis.The Scientist (2022). URL: https://www.the-scientist.com/news-opinion/scientists-identify-neurons-needed-to-walk-after-paralysis-70744