体内基因组编辑，有效，可预防肥厚性心肌病

使用腺嘌呤碱基编辑器和Cas9核酸酶的两种方法在携带Myh6基因致病性突变的小鼠中防止肥厚性心肌病的发展，突出了单剂量基因疗法治疗心脏病的潜力。

　　

心肌肌球蛋白重链的显性错义致病变异导致肥厚性心肌病(HCM)，这是一种目前无法治愈的疾病，会增加中风、心力衰竭和心源性猝死的风险。在这项研究中，我们评估了两种不同的遗传疗法——腺嘌呤碱基编辑器(ABE8e)和由AAV9传递的强效Cas9核酸酶——来预防携带杂合HCM致病变异肌球蛋白R403Q的小鼠患病。一剂双载体，每个载体携带一半RNA引导的ABE8e，纠正了≥70%的心室心肌细胞的致病性变异，并保持持久、正常的心脏结构和功能。额外的剂量提供了更多的心房编辑，但也增加了旁观者的编辑。AAV9递送RNA引导的Cas9核酸酶有效地灭活了致病等位基因，尽管具有剂量依赖的毒性，需要一个狭窄的治疗窗口来维持健康。这些临床前研究证明了单剂量基因疗法在纠正或沉默致病变异和预防HCM发展方面的巨大潜力。

肥厚性心肌病(HCM)是一种原发性心肌疾病，估计每500个人中就有一人发生，导致左室肥厚(LVH)，左室体积减少，心肌纤维化增加。HCM源于改变肌节成分的显性变异，包括收缩蛋白心肌肌球蛋白重链。致病性肌球蛋白变异在成年早期产生有症状的HCM，不良结局率高，包括心力衰竭、心律失常、中风和心源性猝死。虽然药物和设备可以减少心律失常和心源性猝死，但治疗不能预防心力衰竭，心力衰竭是HCM4患者心脏移植和过早死亡的主要原因。

HCM分子基础的发现使早期、基于基因的诊断和临床表现的纵向评估成为可能。致病性变异的儿童携带者通常表现出一个持续时间不等的潜伏期，当LVH和症状消失时，而成年人表现出LVH，这是HCM的诊断标准。尽管影响疾病发生的因素尚不清楚，但疾病的这一自然史为限制或预防疾病的潜在干预提供了一个机会窗口。

核酸疗法是治疗遗传性疾病的潜在药物。基于RNA的治疗(小干扰RNA或发夹RNA和反义寡核苷酸)是有效的，但时间短暂，需要反复给药以获得长期疗效。或者，可以通过载体，如腺相关病毒(AAV)传递的基因组编辑器实现永久DNA修饰。

我们之前在小鼠Myh6基因中设计了一个与人类p.R403Q等位基因同源的杂合致病性肌凝蛋白变体，该基因编码了小鼠心脏肌凝蛋白的主要亚型。携带一个R403Q变异等位基因的129SvEv小鼠再现了人类HCM的关键特征，包括LVH、心室容积改变和心肌纤维化。

利用R403Q小鼠，我们发现在心肌细胞特异性鸡肌钙蛋白T (Tnnt2)启动子的控制下，将一种由AAV9编码的小干扰RNA (siRNAs)送入胸腔可选择性地沉默突变转录。降低25%的突变转录物水平足以防止6个月的LVH的出现，此后持续性下降。

我们最近在转基因小鼠中研究了碱基编辑器疗法，这种转基因小鼠表达一种致病性层膜蛋白变体，可导致人类早衰症16伴心血管疾病。使用双AAV9载体，每个载体包含一半的分裂腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，以克服AAV9载体全长碱基编辑器的包装限制(~4.7 kb)，我们在心血管组织中实现了适当的基因组编辑(~ 20-30%)，使小鼠的生存时间比未处理的小鼠长两倍。

利用这些进展，我们和随附手稿的作者(Chai等人)评估了在R403Q小鼠中编辑或沉默HCM等位基因的不同策略。我们报告了基因组编辑纠正了超过70%的突变转录本，具有可容忍的编辑旁观者核苷酸的频率(例如，接近目标腺苷残基)。治疗具有良好的耐受性，并可预防小鼠模型中缓慢或快速出现的HCM功能、组织病理学和分子表型。我们还评估了R403Q等位基因的永久沉默，使用金黄色葡萄球菌Cas9，编码在单个AAV9载体中。这种策略有效地编辑心肌细胞并预防LVH，但对收缩功能有剂量依赖性的有害影响，表明治疗窗口狭窄。