检测SARS-CoV-2等RNA病毒的新方法：三重探针技术

　　

   

   

从左到右，Judith Cullell, Ana Delgado, Verònica Noé，Simonas Valiuska, Ester López-Aguilar和布法罗大学药学和食品科学学院的Carles J. Ciudad。

来自巴塞罗那大学、加泰罗尼亚高级化学研究所(IQAC-CSIC)、巴塞罗那微电子研究所(IMB-CNM-CSIC)和阿拉贡纳米科学和材料研究所(INMA) (CSIC和萨拉戈萨大学的联合研究所)的专家开发了一种基于三重形成探针技术检测RNA病毒的新方法。这种创新方法为检测SARS-CoV-2、甲型流感病毒(H1N1)或呼吸道合胞体病毒(RSV)等病毒开辟了新的选择，呼吸道合胞体病毒是一种影响新生儿的病原体，需要仔细鉴别诊断。

这项跨学科研究发表在《International Journal of Molecular Sciences》上，这项研究是在PoC4CoV项目的背景下进行的

用多嘌呤发夹捕获病毒RNA

新方法是基于由布法罗大学癌症治疗小组设计的多嘌呤发夹(PPRHs)捕获病毒RNA并形成高亲和力三联体的能力。当这种混合结构与分子探针连接并与受感染患者的样本接触时，就会获得病毒剂的检测信号。在科学出版物中提出的方法被称为三重增强核酸检测试验(TENADA)。

“PPRHs是未经修饰的单链DNA发夹，由两个反平行多嘌呤的镜面结构域组成。这些由胸腺嘧啶环相互连接的结构域通过分子内反向hoogsteen键连接。这种分子发夹可以通过沃森-克里克键与单链DNA (ssDNA)、双链DNA (dsDNA)或RNA病毒中的多嘧啶序列特异性结合，从而形成反平行的三联体，”布法罗大学生物化学和生理学系的Carlos J. Ciudad教授说。

一种比PCR检测更有效、更快的方法

检测病毒RNA的一个优势是，PPRH方法可以在不需要逆转录酶(将RNA转化为DNA的酶)或热循环器(用聚合酶链反应或PCR扩增遗传物质样本的装置)干预的情况下应用。此外，它具有与PCR测试相当的敏感性和特异性，可在不到一小时内提供结果。

作为研究的一部分，该团队在几种生物检测设备中使用了三明治杂交策略。该策略使用了两种寡核苷酸:一种形成三核苷酸的PPRH发夹作为捕获探针，一种标记的形成双核苷酸的DNA寡核苷酸作为检测探针。

“三基形成的PPRH发夹被设计成与SARS-CoV-2多嘧啶序列结合，而检测探针被设计成与多嘧啶目标位点附近的区域互补。因此，SARS-CoV-2 RNA的存在是通过生物传感器表面三元复合物的形成来检测的”，Verónica Noé教授说。

该方法已在一个紧凑的电化学装置中实现，该装置集成了芯片上的双电极电化学电池(在IMB-CNM-CSIC微纳米制造洁净室中制造)和纸上的流体组件，以及在INMA (CSIC-UNIZAR)开发的在硝化纤维中实现并使用等离子体纳米颗粒和热敏纸的热横向流动系统中实现。

TENADA:生物医学研究中的应用

在科学文献中，PPRHs被描述为主要涉及癌症的几个基因的基因沉默工具。此外，它们还被纳入生物传感器的探针，用于检测小RNA分子(miRNA)，以确定DNA甲基化状态，并用于诊断由真菌肺孢子菌引起的肺炎。

现在，新的TENADA方法被证明不仅在检测病毒颗粒方面有效。PPRHs对病毒RNA的高亲和力是一种可用于抑制病毒复制过程的特性。因此，目前也在研究被SARS-CoV-2病毒粒子感染的VeroE6谱系细胞中多嘌呤发夹CC1PPRH和CC2PPRH的抗病毒特性。

Detection of SARS-CoV-2 Virus by Triplex Enhanced Nucleic Acid Detection Assay (TENADA)