4分钟长读技术对单细胞进行测序

【字体: 时间:2023年03月10日 来源:The Scientist

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  4分钟读取通过结合两种创新方法,研究人员现在可以对单个细胞基因组之间的突变差异进行全谱测序。

  

传统的测序经常被比作制作冰沙:研究人员混合一堆细胞,获得平均序列,并对构成冰沙的成分得出结论。最近,科学家们已经获得了进行单细胞测序的能力,这可以揭示细胞之间的罕见变异和细胞谱系的进化。但目前的方法需要短时间内读取基因组,因此往往无法捕获复杂的重复区域,而科学家们越来越多地将这些区域与健康和疾病联系起来。长读技术可以克服这个缺陷;然而,他们的方法需要比从单个细胞中提取更多的DNA。令人沮丧的是,单细胞长读测序仍然遥不可及。

直到现在。荷兰内梅亨大学医学中心的基因组技术研究员Alexander Hoischen(他没有参与这项研究)说,通过结合“两种非常创新的方法”——尖端的DNA扩增技术和DNA测序的最新进展——一组科学家已经将长读技术应用于单细胞。Hoischen说:“这在两三年前是不可想象的。这一壮举可能会让人们更详细地了解各种疾病背后的突变。在过去的十年里,DNA测序的产物读数变得越来越长。长读测序使科学家能够对基因组中麻烦的“暗区”进行测序,这些“暗区”是短读技术无法到达的,要么是由于鸟嘌呤和胞嘧啶的丰富,要么是不容易映射到染色体上的重复区域。

然而,长读测序需要大量的DNA。需要几微克的遗传物质,但“一个细胞只含有6皮克,所以在使用长读方法对它进行测序之前,需要大量的扩增。这就是事情变得棘手的地方,因为用于放大DNA的主要方法容易出现“放大偏差”:倾向于以牺牲其他序列为代价来增加某些序列。现在,使用改进的DNA扩增方法从单个细胞中获得了长读数。虽然尚未经过同行评审,但研究结果已于1月23日以预印本形式上传到bioRxiv。

为了最大限度地减少放大偏差,该团队使用了一种称为基于液滴的多重位移放大技术。它的工作原理是将DNA片段捕获在含有有限试剂的液滴中,防止某些区域的过度扩增。“这是一种更均匀的放大,所以你可以更好地代表基因组。”研究人员在个体人类T淋巴细胞上进行了基于液滴的扩增,然后使用PacBio HiFi技术生成长读取。与短读测序相比,新方法捕获了四倍多的结构变异——DNA的大规模重排——包括那些位于基因组不可接近的“黑暗区域”。

研究人员使用这种新方法对来自同一个人的两种不同T细胞的DNA进行测序。他们的测序数据揭示了区分这两个细胞的28个体细胞突变,包括线粒体DNA的变化。这种新方法可以让科学家研究体细胞突变对多种疾病的影响。

例如,当不同的细胞独立获得突变(称为亚克隆突变)时,肿瘤通常显示出遗传变异的马赛克,这使肿瘤更具侵袭性。改进的单细胞DNA测序可以帮助“梳理出经常隐藏在癌症中的亚克隆突变,”纽约威尔康奈尔医学院的生物物理学家Christopher Mason说,他没有参与这项研究。

健康的细胞在其一生中也会积累突变,尽管这在定期补充的皮肤和肠道细胞中不像在我们大脑中长寿的细胞中那样令人担忧。但神经元和其他脑细胞的体细胞突变可能会影响大脑功能,并可能导致神经系统疾病,包括精神分裂症、妥瑞氏症和自闭症。

亨特学院的研究人员Constantina Theofanopoulou没有参加这项研究,她说她的研究已经受益于DNA测序的进步。对脊椎动物基因组的长期研究帮助她揭示了使社会交流成为可能的受体和配体的进化史。但她说,从单细胞中获得的长读取可能是识别她所研究的语言障碍基因变异的关键工具。

然而,研究人员承认,这项技术并不完美。虽然比目前放大DNA的方法更好,但基于液滴的扩增会产生错误和嵌合体,即基因组的非相邻部分粘在一起。尽管他们能够在当前的工作中识别和去除嵌合体,但他们严格的过滤方法也会产生正确的读取结果。该团队正在优化条件,以减少扩增过程中的错误。

这项原则性的研究表明,在大样本中对长读取所做的任何事情,也可以在单细胞水平上完成。现在,我们真的可以更详细地研究单个细胞。



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