看NanoDrop是如何智能识别核酸中的蛋白质污染

【字体: 时间:2023年03月03日 来源:

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  NanoDrop One/OneC和NanoDrop Eight超微量分光光度计内置了Acclaro智能污染物分析系统,能够基于光谱数据库和独特的算法准确识别、鉴定出待测样品中的污染物质,并实时给出校正后样品真实浓度。

苯酚-氯仿法是核酸提取的经典方法,却极易在回收水相中的核酸时引入蛋白污染。这将导致:1、A260读数偏高(核酸在260nm处有吸收),计算核酸浓度偏大;2、污染蛋白通过抑制或干扰酶促反应,影响下游的RT-PCR及qPCR结果。但是由于蛋白质的消光系数远小于核酸的消光系数(蛋白中色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸的二硫键在280nm处有吸收),因此需要蛋白质浓度达到较高的水平才能在A260/A280的比值上体现出来(Glasel, 1995, Huberman, 1995, and Manchester, 1995)1-3,这给核酸中的蛋白质污染鉴定带来很大难度。

针对这一难点,NanoDrop One/OneC和NanoDrop Eight超微量分光光度计内置了Acclaro智能污染物分析系统,能够基于光谱数据库和独特的算法准确识别、鉴定出待测样品中的污染物质,并实时给出校正后样品真实浓度(图1)。今天我们通过实验解析蛋白污染对核酸样品纯度、定量的影响,以及NanoDrop One是如何准确识别此类污染,并给与准确校正的。

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图1 Acclaro智能污染物识别功能提示样品中可能存在的污染物。1a)检测结束之后,在浓度前会显示黄色三角形,提示在此dsDNA样本中检测到污染物。1b)吸光度光谱图中,蓝色表示原始光谱(DNA加污染物)、绿色表示修正后光谱 (DNA减污染物)、黄色标识污染物光谱,右上角给出包括校正前后的样品浓度、A260/A280、A260/A230比值和存在的污染物及类型。

将dsDNA标准品(鲑鱼精子DNA溶液)和蛋白样品(BSA溶液)按照不同比例混合得到九组混合物(见表1)。使用NanoDrop One分别测量九组混合物dsDNA浓度,每组溶液均重复测量五次,计算平均浓度和标准偏差(SD)(结果见表2)

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表1 不同量的DNA 和蛋白原液混合比例

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表2 NanoDrop One 测量混合物中DNA浓度

表2中,The original(uncorrected)DNA 浓度是NanoDrop One直接测出的数据,The corrected DNA浓度(混合物5–9)是NanoDrop One Acclaro软件分析并校正后的数据(注:混合物1-4由于污染蛋白浓度过低,不足以触发Acclaro软件的分析校正功能,因此使用Thermo Scientific™ TQ Analyst™ software package来做光谱分析完成数据校正。)

观察该表中original DNA浓度数值及纯度比值,可以看出蛋白污染对核酸样品浓度的影响规律:

1)不同程度的蛋白污染,都会导致核酸浓度虚高。且污染蛋白含量越高,核酸的测量值和真实值偏差越大。

2)足够高的蛋白含量才能够引起260/280纯度比值的显著变化。本例中污染蛋白比例占到近72%时,A260/A280纯度比值为1.74,仍处于可接受范围内。当污染水平从72%增加到98%时,A260/A280纯度比值才从1.74稳步降至0.89。

同时,从该表中corrected DNA浓度以及黄色警示标识表示可以看出NanoDrop One的污染物校正功能特点:

1)能够准确识别并且定量核酸样品中的蛋白污染,超出一般实验可接受范围时给与警示符号提示。

2)使用Acclaro软件,校正后的核酸浓度与真实值的偏差控制在10%范围内。即使对于98%的极端蛋白污染浓度,Acclaro给出的校准值依然在此范围内,且具有高度可重复性。

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表3 所有混合物的校正浓度均在实际DNA浓度的10%以内

NanoDrop One/OneC和NanoDrop Eight内置的Acclaro智能污染物分析系统提供了一种全新的计量学方法,帮助研究人员:1、确定样本中的污染物类型;2、确定污染物浓度;3、获得校正后的核酸浓度;极大地降低了核酸质控的难度,节约了时间成本、减少了耗材浪费

引用文献

1. Glasel, J.A. 1995. Validity of nucleic acid purities monitored by 260 nm/280 nm absorbance ratios. Biotechniques 18:62–63.

2. Huberman, J.A. 1995. Importance of measuring nucleic acid absorbance at 240 nm as well as at 260 nm and 280 nm.Biotechniques 18:636.

3. Manchester, K.L. 1995. Value of A260/A280 Ratios for the Measurement of Purity of Nucleic Acids. Biotechniques 19:208-210.

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