新方法快速有效的检测miRNAs

MicroRNAs (miRNAs)是调节许多生物过程的小RNA分子。它们有可能成为生物标志物，因为一些疾病会使它们失调，但它们的检测太耗时。在最近的一项研究中，来自中国的科学家通过将两种成熟的生物化学工具结合到一种新的miRNA检测方法中来解决这个问题。他们的创新方法可能为即时检测miRNA诊断癌症等疾病铺平道路。

　　

   

   

与预环化的环状探针杂交后，通过RCA将目标miRNA扩增成具有大量触发序列重复的长ssDNA产物。该触发序列被设计为Cas12a的激活剂，以显示反式裂解活性。然后，触发链被Cas12a-crRNA双工识别并与之杂交。然后触发Cas12a显示反式裂解活性，F-Q探针(一个ssDNA探针，在5 '端标记一个荧光团，在3 '端标记一个猝灭剂)被裂解，导致猝灭剂从荧光团分离，产生荧光信号

20世纪90年代初，研究蛔虫发育的科学家发现了一种调节特定基因表达的小RNA分子。这标志着microRNAs (miRNAs)的发现，现在已知它存在于所有形式的生命中。事实证明，这些分子在许多生物过程中起着至关重要的作用。几年后，研究人员意识到疾病可以失调microRNAs的表达，突出了它们作为生物标志物的潜力。事实上，异常的miRNA表达是所有肿瘤相关疾病的标志。因此，miRNA检测技术可能有助于癌症的早期检测。

然而，由于miRNAs体积小且易于降解，使得其难以快速检测和定量。为了检测样品中的miRNAs，通常需要首先“扩增”它们。简而言之，这意味着通过生化过程多次复制目标miRNA，以便通过廉价的方法更容易检测到该miRNA。不幸的是，大多数最先进的miRNA扩增技术可能需要5个多小时才能完成，这限制了它们在即时检测中的应用。

在此背景下，包括中国清华大学Chong Zhang副教授在内的一个研究小组最近开创了一种快速扩增和检测miRNA的新方法。正如他们在2023年3月27日发表在《生物设计研究》(BioDesign Research)杂志上的最新论文所解释的那样，团队将两种研究得很好的生物化学技术结合在一起，从而大大减少了所需的总体时间。

他们使用的第一种技术被称为滚动圈放大(RCA)。在RCA中，想法是设计一个圆形的DNA分子或“探针”，目标RNA片段可以与之结合。然后，一旦DNA聚合酶和必要的DNA构建块被引入，通过添加与圆形探针互补的核苷酸来扩展RNA片段。这一过程产生了一条长而单链的遗传物质，其中包含了圆形探针的多个拷贝。

这就是第二种技术CRISPR-Cas12a发挥作用的地方。CRISPR-Cas12a是一种广泛使用的遗传工具，其中一个分子复合物被设计成与特定的DNA序列结合。在这种情况下，研究人员设计了这种复合物，使其与圆形探针互补序列中的一个区域结合。也就是说，CRISPR-Cas12a复合物沿着通过RCA产生的单链DNA多次结合。一旦这些复合物结合，Cas12a部分就会被激活，将荧光探针与其猝灭剂分离。反过来，这产生了一种易于检测的荧光信号，初始目标RNA被扩增得越多，荧光信号就越亮。

除了这些技术的结合，研究人员还通过使用“预循环探针”改善了RCA步骤的反应时间。也就是说，与大多数标准的RCA程序不同，在反应之前，探针被赋予了圆形。正如张教授所说，这使得检测过程更快，而不影响系统的性能:“miRNA的检测可以在70分钟内完成，而不是通常的5小时，具有8.1 pM的极好检测限和非常高的特异性。”

总的来说，该方法为miRNA检测及其作为生物标志物的应用描绘了一个光明的未来。Zhang教授对结果感到满意，总结道:“我们的设计提高了CRISPR-Cas和基于RCA的传感策略的效率，并在实验室检测和护理点测试中显示出巨大的潜力。”由于在这种方法中使用的技术并不昂贵，也不复杂，因此在临床环境中广泛采用所提出的方法是可行的。

这些努力将为更好地诊断癌症和其他影响miRNA表达的疾病铺平道路。

Exploring the Trans-Cleavage Activity with Rolling Circle Amplification for Fast Detection of miRNA