预印本：更好的细胞图谱与全长同种异构体测序

 

 
了解无数不同的细胞类型、状态及其功能对理解生物学至关重要。细胞图谱计划和联盟的目标是绘制组织、器官和生物体中不同类型的细胞，生成一个参考资源，可以帮助我们更好地了解人类健康和疾病。RNA测序技术是这些举措的关键，越来越多的研究人员发现，向全长转录本测序的转变可以更详细、更完整地了解细胞类型，将研究领域从基因转移到转录异构体分析。PacBio的批量和单细胞长读异构体测序提供了更全面的转录组视图，为细胞图谱计划提供了强大的工具。

加州大学洛杉矶分校、宾夕法尼亚大学和合作者的研究人员发表了一篇题为Cell-type-specificity of isoform diversity in the developing human neocortex informs mechanisms of neurodevelopmental disorders的预印本文章，提出一种新的细胞特异性基因异构体表达图谱，重塑了我们对大脑发育和疾病的理解。这是一种范式转变。

转录组学的新时代

该研究强调了短读的局限性，“由于短读scRNA-Seq的技术限制，以前的基因组表征在很大程度上局限于基因水平的变化，无法捕捉到人类大脑中选择性剪接的全部复杂性和由此产生的异构体多样性。”为了克服这些限制，研究人员利用大量和单细胞Iso-Seq方法的形式利用HiFi测序，“我们利用单分子长读测序在组织和单细胞分辨率上深入分析发育中的人类新皮层生发区(GZ)和皮质板(CP)区域的全长转录组。”他们发现，Iso-Seq读取具有更高质量的转录组特征“超过99%的全长序列与人类参考基因组相匹配，比短读RNA-Seq的85%的映射率有显著提高，促进了新剪接异构体的发现。”

结果包括:

• 共检测到214,516种独特的异构体，覆盖22,391个基因，其中72.6%是新的异构体，而许多异构体被预测在蛋白质编码水平上具有功能影响，并得到肽证据的支持。总的来说，这一新资源将蛋白质组扩展了超过92,000种蛋白质形态。

• 鉴定了27 Mb的人类基因组，这些基因组在发育中的人脑中具有转录活性，但目前尚未在Gencode中注释。

• 表征皮层神经发生过程中新的异构体开关，暗示在细胞身份和疾病中先前未表征的RNA结合蛋白介导和其他调节机制。

• 基于异构体的单细胞聚类识别出亚簇和过渡状态，而使用基于基因的单细胞聚类则无法识别。

利用这一新资源，研究人员写道“重新确定与神经发育障碍相关的数千种罕见的新生风险变异的优先级，并揭示风险基因与每个基因观察到的独特同种异构体的数量密切相关。揭示了在发育中的新皮层中转录异构体多样性对细胞身份的重大贡献，阐明了神经发育和神经精神疾病的新遗传风险机制，并为发育中的人类大脑提供了全面的以异构体为中心的基因注释。”

全长转录异构体分析揭示了生物学和疾病的新见解

这些发现代表了该领域许多研究的共同主题-单细胞Iso-Seq数据具有极大扩展我们对表达转录物的认识的能力。

一项名为Single-cell long-read mRNA isoform regulation is pervasive across mammalian brain regions, cell types, and development的研究，来自威尔康奈尔大学的研究人员全面分析了多个小鼠大脑区域、细胞亚型和发育时间点的全长RNA异构体。同样，他们发现，“高精度的单细胞PacBio读取识别了新的剪接位点，将GENCODE注释提高了22.1%(40184个转录本)，”并且“对于75%的基因，全长异构体表达沿着表型起源的一个或多个轴变化，强调了异构体调节在多个尺度上的普遍存在。”然后就在上周，在癌症研究领域，另一份预印本，题为An isoform-resolution transcriptomic atlas of colorectal cancer from long-read single-cell sequencing描述了“第一个亚型分辨率CRC[结直肠癌]转录组图谱”，确定了肿瘤细胞中数百个失调的转录结构，其中包括近300个由多种剪接事件的不同组合引起的转录结构。

除此之外，Iso-Seq方法还具有以各种其他方式增强单细胞图谱研究的潜力——一个值得注意的例子是它能够改善基因组注释。最近，比利时鲁汶的研究人员在一项名为“单细胞测序”的研究中强调了这一点，该研究揭示了快速衰老的鳉鱼(N. furzeri)大脑中形成神经和胶质细胞形成的细胞多样性。在这里，研究人员指出，Iso-Seq方法产生全长转录本，从而获得更高的准确性和更好的基因组覆盖率。这反过来又提高了短RNA-Seq读取的定位“从45%到69%”，有助于改善我们最终的基因组注释文件，并确保更高的定位精度和覆盖率，以执行基于seurat的单细胞测序分析”值得注意的是，Iso-Seq方法实现了更高的细胞图谱分辨率——最初的研究中有17种细胞类型，现在通过包含Iso-Seq数据增加到25种细胞类型。

如果你有兴趣建立一个更全面和准确的细胞图谱，HiFi测序可能正是你一直在寻找的解决方案。新的用于单细胞研究的Revio系统和MAS-Seq试剂盒提供了卓越的准确性和效率，这将很快得到最近宣布的批量Iso-Seq应用的吞吐量增加的补充。