如何克服组氨酸标签蛋白出现在流穿中的问题

【字体：大中小】 时间：2023年05月05日 来源：

编辑推荐：

　　有时组氨酸标签的目标蛋白质出现在流穿中，不会有效地与亲和柱结合，从而无法有效的捕获目标蛋白和进行后续纯化。虽然这种情况不是很常见，但一旦发生就会非常令人沮丧。下面将逐步讨论几点排查方向和可能的解决方案。

组氨酸标签蛋白的纯化

组氨酸标签蛋白与其他亲和标签相比，组氨酸标签具有许多优点，例如体积小、与 IMAC 树脂（螯合金属亲和层析色谱）结合的亲和力高，有时可以实现一步纯化重组蛋白的目标。因此很多用户选择使用 IMAC纯化组氨酸标签的蛋白质，且过程相对容易，但它并非完全没有挑战。有时组氨酸标签的目标蛋白质出现在流穿中，不会有效地与亲和柱结合，从而无法有效的捕获目标蛋白和进行后续纯化。虽然这种情况不是很常见，但一旦发生就会非常令人沮丧。如果出现此类问题，可以通过多种方法进行故障排除，下面将逐步讨论几点排查方向和可能的解决方案。

首先，您使用的缓冲液和细胞裂解液是否需要优化？

传统IMAC树脂(e.g. Ni-NTA) 对 DTT 等还原剂和 EDTA 或 EGTA 等螯合剂的存在很敏感，确保样品缓冲液不含任何这些物质或者含量极低，因为它们会影响 IMAC 树脂的结合能力。

这些成分会在样品加载过程中从 IMAC 填料上剥离螯合的金属离子。如果目标蛋白浓度低，情况可能会更加复杂。获得足够量的纯蛋白质需要大量样品，这会进一步导致金属离子剥离增加。

解决此问题的一种方法是在加载到 IMAC 柱之前准备好样品。样品制备可包括样品的澄清和浓缩以及缓冲液更换步骤。这种预处理可能非常耗时，并且会对敏感蛋白质产生负面影响。

另一种解决方案是使用对以上成分有耐受功能的树脂，例如WorkBeads NiMAC或相应的预装柱 GoBio mini NiMAC。镍离子与这种 IMAC 树脂的结合非常牢固，以至于通常会导致金属离子剥离的样品无需预处理即可上样到树脂上。WorkBeads NiMAC已被证明在存在高达 20 mM EDTA和20 mM DTT 的情况下目标蛋白仍然与树脂结合。

WorkBeads™ NiMAC：

▪ 可耐受20 mM EDTA螯合剂和 20 mM DTT还原剂，免去上样前的样品预处理

▪ Ni2+离子结合牢固，脱落微乎其微

▪ 无需繁琐的再生步骤

▪ 高达40mg/ml动态结合载量

▪ 复性高，纯度高

通常在蛋白质结合缓冲液中保持 10-25mM 的咪唑浓度，以防止非特异性蛋白质与 IMAC 树脂结合，建议检查结合缓冲液中的咪唑浓度，有时甚至浓度较低咪唑也可以阻碍目标蛋白结合到 Ni-NTA 树脂或者其他IMAC树脂上。在这种情况下，应仔细尝试不干扰目标蛋白与亲和树脂结合的较低浓度的咪唑。

另一个关键因素是缓冲液的 pH 值。当缓冲液的 pH 值较低时，它会导致组氨酸侧链质子化，从而影响组氨酸残基与IMAC的结合。通常建议将缓冲液的 pH 值保持在7-8。添加咪唑可降低 pH，因此建议在添加咪唑后调整结合缓冲液的 pH。

最后，缓冲盐是否合适：如果缓冲液中的Tris,HEPES,MOPS等含有仲胺或叔胺的缓冲盐，因为含有仲胺或叔胺的缓冲盐会影响组氨酸标签蛋白与Ni-NTA 树脂的结合，当然在某些情况下可以使用高达 100 mM的此类缓冲盐。在缓冲液的优化中，如果其他方法都没有能显著改善目标蛋白与Ni-NTA 树脂的结合的话，可以尝试更换缓冲盐（例如Tris更换为磷酸盐）, 可能会提高组氨酸标签蛋白的挂柱能力。

第二点，确保在正常的纯化条件下使用IMAC树脂，并且其是正常工作的。

当纯化时目标蛋白和色谱柱接触时间过短会增加目标蛋白无法有效结合的风险，可以适当降低上样流速，以延长蛋白和色谱柱的接触时间。

为确保IMAC树脂正常工作，还可以在同一缓冲液中对对照组氨酸标记蛋白（之前已使用 IMAC 纯化的蛋白）与您感兴趣的蛋白质进行对比。如果对照蛋白与IMAC树脂结合并洗脱，但您感兴趣的蛋白继续出现在流穿和并在洗脱中没有出现的话，那么需要寻找其他原因了。当流穿液和洗脱液中都有目标蛋白时，有可能是由于样品的蛋白超过柱子的载量，可以尝试更换体积大的柱子或者减小上样量。

第三点，蛋白的组氨酸标签是否完全暴露？

某些蛋白质可以在其天然结构中隐藏多组氨酸标签，从而阻止蛋白质与 IMAC 亲和柱的结合。当组氨酸标签的无法暴露可能是由于标签被埋在折叠蛋白质的三维构象中。可以通过在蛋白中加入适量的尿素或盐酸胍等变性剂看下目标蛋白能否挂柱，因为尿素和盐酸胍都是强大的变性剂并且会展开蛋白质，如果蛋白质在这些变性剂存在的情况下可以与树脂结合，那么就是说蛋白的折叠隐藏了组氨酸标签并阻止其与 IMAC 树脂结合。

若在变性条件下可以挂柱，可以尝试在变性条件下进行纯化，如果不能接受蛋白变性纯化，那可以在上游分子水平增加组氨酸的长度或或者改变标签的位置(例如从N-末端移到C- 末端)，最佳位置是蛋白质特异性的。也可以在组氨酸标签和目标蛋白之间使用接头序列（例如甘氨酸-丝氨酸重复序列），以减少组氨酸结合的空间位阻。

如果在变性条件下依然无法结合目标蛋白，那么需要考虑组氨酸标签是否还在？大肠杆菌外源蛋白表达过程中，有时候会出现序列丢失的现象，如果标签丢失，蛋白自然就无法挂柱了，检测组氨酸标签，可直接用anti-His抗体通过用Western-Blot方法检测。

另外对IMAC树脂的金属离子选择也需要考虑在内。

如果蛋白表达含量比较低或者与所选IMAC树脂的亲和力不够，可以选择用于其他对目标蛋白亲和力更强的金属离子，比如 IMAC 的典型金属离子通常以 Co2+、Ni2+ 和 Cu2+ 的顺序显示出亲和力的增加。配基的类型也往往会影响蛋白质对螯合金属离子树脂的亲和力，这可能是因为用于蛋白质结合的金属离子的可用配位点数量不同。例如，次氮基三乙酸 (NTA) 配体被认为通过四个配位点螯合 Ni2+ 离子，留下 Ni2+ 离子的两个配位点用于蛋白质结合，而亚氨基二乙酸 (IDA) 配体被认为通过三个配位点与 Ni2+ 离子配位，留下三个位点以获得更强的蛋白质结合。这种亲和力的差异，特别是对于未标记的宿主细胞蛋白（暂定杂质），可能部分解释了使用不同树脂获得的纯化差异。可以补充的是，树脂的配体浓度和结构特性也影响纯化性能。建议测试不同的金属离子螯合的 IMAC 树脂以获得最佳纯化结果，因此GoBio Mini NTA/IDA His-tag Screening kit 可用于初期筛选His-tag蛋白纯化最佳介质。