LI-COR Odyssey高重复性定量数据助力解析泛素链合成机制

英国癌症研究所利用近红外荧光成像技术获得大量的Western Blot、非还原性和还原性SDS–PAGE实验的定量数据解析泛素连接酶（UBE2K）介导K48-多聚泛素链形成机制和过程。

不同类型的泛素(Ub)链参与不同的生物过程。K48-多聚泛素链通过靶向结合蛋白介导蛋白酶体降解，因为Ub结合具有短暂性的特点，所以泛素链合成的机制难以解析。英国癌症研究所在NAT CHEM BIOL杂志上发表一篇名为Structure of UBE2K–Ub/E3/polyUb reveals mechanisms of K48-linked Ub chain extension的文章，利用近红外荧光成像技术获得大量的Western Blot、非还原性和还原性SDS–PAGE实验的定量数据解析泛素连接酶（UBE2K）介导K48-多聚泛素链形成机制和过程。

部分结果展示

E3连接酶激活UBE2K

作者通过E3 panel确认可激活UBE2K的E3连接酶种类，发现只有部分E3可激活UBE2K（图1），其中RNF38、BIRC2（两种E3）存在时可促进三聚泛素链（tri-Ub）合成（图2）。这说明E3与UBE2K共同作用激活Ub供体（UbD）向受体Ub的转移。基于LI-COR Odyssey近红外荧光成像平台分析获得高重复性（三次重复实验）和定量的数据，结果显示在高pH值条件下，UBE2KD124A抑制di-Ub形成, UBE2KD124N 表现出活性降低（图3）。

图1. a.E3 Panel对UBE2K催化K48-多聚Ub链合成的作用。b.UBE2KD124变体催化多聚Ub链合成作用。

图2. 时间依赖还原性SDS-PAGE结果显示E3对UBE2KWT催化多聚Ub链的作用。

图3. a.Western blots数据显示PH值依赖UBE2KWT, UBE2KD124N和UBE2KD124A 催化二聚泛素链（di-Ub）合成，重复三次。bc.不同pH值下，对（b）UBE2KWT 、UBE2KD124N(C)BE2KD124A催化形成di-Ub链进行定量分析。与UBE2KWT相比，高pH值条件下UBE2KD124N活性降低。

设计不同的变体验证E2/UbD/E3连接保守网络

作者设计了 UBE2KF62A,A102R 和RNF38M417A 变体验证是否会阻碍RNF38/UBE2K的结合，发现两种变体都会阻碍di-Ub合成（图4b）。使用RNF38R454A突变体验证了RNF38关键蛋白精氨酸的重要性，该突变体降低了RNF38的活性（图4c）。设计UbD 变体 I36A 和Q40R，验证是否会阻碍UbD/RNF38表面的结合, 实验结果表明两种变体均阻碍di-Ub链合成。这可能是由于UBE2K内α2-螺旋残基与UbD结合,所以α2-螺旋残基115位丙氨酸（A115）突变成精氨酸阻碍了di-ub链合成。强调了UBE2K–UbD复合物构象的重要性。

图4. 均为非还原性SDS–PAGE成像结果图。b.E3分别招募野生型和突变型UBE2K时di-Ub合成结果。*为荧光标记的Ub；c.野生型和突变型RNF38存在时di-Ub合成区别。d.RNF38存在时UbD突变体对di-Ub合成的影响；e.RNF38分别与UBE2K D94A 和UBE2K A115R 混合时di-Ub合成结果。

图5. 非还原性SDS–PAGE显示在没有E3时，UBE2KF68A,A102R对di-Ub合成影响较小。

UBE2K 通过UBA结构域被Ub-底物蛋白募集

与UBE2KM172D,L198R变体相比，UBE2KWT提高了Ub-SMAC（三分子及以上泛素修饰）泛素化修饰水平（图6c）。加入BIRC2147-C后更多Ub转到SMAC-Ub3–5复合物上，同时恢复UBE2KM172D,L198R变体催化Ub到SMAC-Ub3–5的能力（图6d）。随即通过引入UBE2KE167A,C170R,R176A变体确认UBA结构域（Ub-associated）中二级Ub结合位点，与UBE2KWT相比，UBE2KE167A,C170R,R176A催化合成SMAC-Ub3–5泛素化修饰水平降低。分别验证多种UBE2K变体对SMAC-Ub3–5泛素化水平影响，通过LI-COR Odyssey近红外荧光成像平台检测获得图像（图6e），ImageStudio软件分析图像中的条带获得定量数据（图6f），结果显示与UBE2KWT相比，UBE2KM172D,L198R变体催化SMAC-Ub3泛素化修饰水平下调75%，UBE2KE167A,C170R,R176A变体催化SMAC-Ub3–5泛素化修饰水平下调36%。整合分析，发现UBA结构域上的经典和新挖掘的次级Ub结合位点都有助于UBE2K被招募到泛素化底物上，从而促进Ub链的延伸。

图6. 为非还原性SDS–PAGE荧光成像图。c.UBE2KWT(左)和UBE2KM172D,L198R（右）转移UbD到SMAC, SMAC-Ub1-2, SMAC-Ub3-5 和SMAC-Ub5+的结果。d.加入/不加入BIRC2147-C条件下分析UBE2KWT和UBE2KM172D,L198R催化SMAC-Ub3-5泛素化过程。e.没有E3条件下,UBE2K变体催化SMAC-Ub3-5泛素化过程。f.结果e中反应2min时间下合成的SMAC-Ubn泛素化水平进行定量分析。

本文提出了一种化学捕获复合物UBE2K–Ub/E3/polyUb，该结构可以捕获UBE2K与E3连接酶（RING E3）、UbD和受体复合物K48-di-Ub短暂状态，揭示了UBE2K活性位点残基和C端UBA结构域（Ub-associated）识别受体Ub的基础，解释了K48-泛素链特异性和催化作用的原理。同时发现UBA结构域具有多个Ub结合表面介导K48-和k63-Ub链的特异性结合以及泛素结合多价性克服了弱受体Ub亲和性特性实现UBE2K与泛素化底物结合，从而促进链的延伸。文中大量的泛素化验证实验数据均由LI-COR Odyssey近红外荧光成像平台扫描并分析，该平台家族目前型号丰富满足多种应用，并提供完整的Western Blot解决方案。

准确的检测平台

LI-COR Odyssey家族

近红外荧光成像技术，产生稳定的近红外荧光信号，与传统的化学发光相比，信号不受曝光时间、温度等影响，信号与目标蛋白丰度成很好的线性比例关系，因此定量数据更准确、实验重复性更高。

宽动态范围，同一次扫描可同时成像高丰度和低丰度蛋白质，不同梯度条件下，采集弱信号的同时避免强信号饱和。

在不同的凝胶/膜上比较目标蛋白的表达丰度高低，容易引入误差和变量。该平台能够在一张膜上同时检测多种蛋白，无需Stripping 和Reprobing，能更好地满足期刊杂志对检测多种蛋白数据发表的要求。

同时成像目标蛋白和总蛋白（均一化策略）

稳定的试剂

• 近红外荧光二抗发射光谱窄，不同荧光基团间也无交叉反应，非常适合于同时检测多种荧光；亮度高、光稳定性好；成本低。

• REVERT Total Protein Stain：总蛋白染色试剂，期刊杂志推荐的WB 均一化方法。

• Odyssey Loading Indicator（Oli）：实时显示，监控跑胶、转膜过程，评判内参蛋白是否表达恒定。

集成化分析软件Empiria Studio™

• 软件具有强大的验证、分析、报告功能，完美的满足了期刊杂志对高质量数据（从原始图像获取到重复性分析）的所有的要求。

• 支持导入图片后自动完成分析并且操作流程简单，减少了不同操作人员之间的误差以确保获得准确的分析结果。

• 几分钟之内即可完成常规分析方法60-120分钟的工作量。

完善的protocol与培训服务

LI-COR Biosciences公司作为近红外荧光成像的创始者，在近红外荧光成像领域已有几十年的积淀。由于LI-COR Odyssey近红外荧光成像系统可实现Western Blot精确定量，多重Western Blot检测，且重复性更高，通量更高，拥有丰富的应用范围，因而得到了全球生物医学研究人员的信赖。

可实现丰富的应用

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参考文献：Nakasone M A ,  Majorek K A ,  Gabrielsen M , et al. Structure of UBE2K–Ub/E3/polyUb reveals mechanisms of K48-linked Ub chain extension[J]. Nature Chemical Biology.

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