肿瘤研究新方向：挖掘单细胞ecDNA及基因组变异

单细胞全基因组测序(scWGS)可以有效揭示生物样品中不同细胞之间的异质性，并系统鉴定单个细胞基因组中发生的遗传变化。目前的scWGS均基于NGS平台，测序读长相对较短(通常只有150bpX2)，主要适用于检测单个细胞中的单核苷酸变异(SNV)、小的插入缺失(<50bp，Indel)、以及拷贝数变异(CNV)等，对基因组中结构变异(SV)的检测有很大局限性。此外，肿瘤研究的新方向——染色体外环状DNA ( extra-chromosomal circular DNA，ecDNA )，一种源自染色体的癌症特异性环状 DNA 分子，碱基对长度在几百~几百万对之间。ecDNA在正常细胞中表达较少，普遍存在人肿瘤组织和肿瘤细胞中。ecDNA上携带的致癌基因在细胞中随ecDNA高度扩增而高表达，在癌症发展中起重要作用。然而目前尚无有效的scWGS方法对包括SV在内的基因变异以及ecDNA进行系统鉴定。

针对这一难题，汤富酬课题组开发了基于PacBio SMRT HiFi测序的单细胞基因组测序技术SMOOTH-seq，能够从单个细胞中扩增出平均长度约6kb的基因组片段，解析单细胞中包括SV在内的变异。由于HiFi测序的准确度目前已高达99.9%以上，因此单细胞SNV，InDel，SV等各种变异以及ecDNA的解析有了技术基础。

SMOOTH-seq五步流程

细胞挑选

  挑选单个K562细胞至单管

裂解及片段化

  裂解细胞，并片段化gDNA

扩增引入Barcode

  每个cell采取含有16bp barcode的PCR引物进行扩增

混合建库

  扩增产物混样并质控，随后进行SMRTbell文库构建

上机测序

  在PacBio Sequel II上进行测序，对来自单细胞基因组的结构变异进行分析

SMOOTH-seq测序流程

SMOOTH-seq结果展示

HiFi测序读长平均6kb左右，最长可达43kb

单个K562细胞中SV检测平均精确度75%

单个K562细胞中CNV（分辨率1Mb）检测精确度高，与bulk组测序数据高度一致

检测到125个ecDNAs，包含 417个基因

检测到典型的BCR-ABL1基因融合以及NUP214-XKR3基因融合

汤富酬课题组开发的基于PacBio Sequel II 单分子实时测序平台的单细胞基因组单分子测序技术(SMOOTH-seq)，将长而准的SMRT HiFi测序技术巧妙运用到了单细胞基因组测序上，能够实现对于基因组结构变异、ecDNA等多种生物学事件的高精度检测。该研究开创了单细胞基因组单分子测序时代，为揭开更多的人类基因组中的“暗物质”奥秘奠定了技术基础。

结合上述单细胞基因组学应用案例，我们将自动化单细胞挑选、PCR扩增、HiFi测序及配套建库等多个单细胞组学必备支撑技术整合成完整的解决方案以便研究者在实验中畅通无阻。

必备支撑技术一

必备支撑技术二

参考文献：Fan X, Yang C, Li W, Bai X, Zhou X, Xie H, Wen L, Tang F. SMOOTH-seq: single-cell genome sequencing of human cells on a third-generation sequencing platform. Genome Biol. 2021 Jun 30;22(1):195. doi: 10.1186/s13059-021-02406-y. 

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