Covaris无偏好的染色质剪切助力低细胞数ChIP方案

【字体：大中小】 时间：2023年06月30日 来源：

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　　很多ChIP实验都会采用Covaris系统，用以提升实验的可重复性和片段的均一性。以下这篇文章的低细胞ChIP方案就离不开Covaris的贡献，我们一起来看看吧~

Background

染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）是研究DNA和蛋白质相互作用的有力工具，常被用来研究转录因子、调控蛋白、修饰组蛋白等与DNA特异性结合位点。然而标准的ChIP-Seq方法每个免疫沉淀反应需要使用百万数量级的细胞，因此对于许多细胞类型来说，细胞数量的限制是获得高质量ChIP-Seq数据的一大障碍，例如小鼠的原始生殖细胞（primordial germ cells，PGCs）。正是由于这一限制，科学界对于胚胎细胞中是否存在二价性以及它与多能性的关系缺乏清楚的了解。

Covaris是一家专注于样本前处理的公司，其独特的专利技术Covaris AFA聚焦超声可被应用于染色质片段化。因此，很多ChIP实验都会采用Covaris系统，用以提升实验的可重复性和片段的均一性。以下这篇文章的低细胞ChIP方案就离不开Covaris的贡献，我们一起来看看吧~

细胞的多能性依赖于表观遗传修饰的调控。二价结构域是指染色质区域同时存在转录激活修饰(H3K4me3)和转录抑制修饰(H3K27me3) 的一种特殊的修饰状态，其被认为在多能性中发挥重要作用，可以使发育基因保持沉默状态，而在准备分化时激活。二价结构域已被证明存在于未分化的胚胎干细胞(ESCs)及几种体内成体组织(包括精子、睾丸、小脑和造血室)的发育调控基因中。然而，动物胚胎中存在二价性的直接证据有限且相互矛盾，双价结构域被证明存在于斑马鱼中，但未在爪蟾或果蝇胚胎中检测到。

PGCs与多能性相关，然而由于在发育过程中存在的PGCs数量较少，该模型的几乎所有证据都来自基于免疫荧光(immunofluorescence，IF)的方法，缺乏基因水平分辨率。为了表征PGCs的染色质状态，来自加州大学洛杉矶分校布罗德再生医学中心和干细胞研究中心的研究人员开发了一种低细胞数染色质免疫沉淀(low-cell ChIP)方案用于分析组蛋白标记。利用该技术，他们进行了ChIP测序(ChIP-seq)和ChIP定量PCR (ChIP- qPCR)，以表明在PGC发育的多个阶段，发育调控基因存在二价结构域。

低细胞ChIP方案

研究人员开发了一种低细胞ChIP方案，使用基于磁珠的捕获，并对现有方法进行了关键改进，包括减少染色质的处理，提高超声重复性，以及不需要载体DNA或DNA预扩增。低细胞ChIP-Seq中，使用Covaris超声处理器进行12分钟的超声，频率为5%，强度为3，脉冲数为200。

后续，研究人员使用表达N端myc标记H3.3组蛋白的转基因小鼠ESC系验证了该方案。对myc-H3.3和对照免疫球蛋白G (immunoglobulin G，IgG)进行ChIP，处理的细胞数量从250万减少到12500。预计与H3.3结合的12个位点中有11个与IgG相比，myc-H3.3的富集程度至少高10倍，这表明了该检测的特异性和低背景。此外，位点之间的相对富集与起始细胞数无关，且保持稳定，证明了该检测的稳健性和敏感性，该方案将广泛用于表征体内罕见的干细胞和前体细胞群的染色质状态。

PCG中二价结构域的分析

接着，研究人员利用开发的低细胞ChIP方案检测了小鼠PGCs中H3K4me3和H3K27me3的全基因组和基因特异性分布。研究发现，胚胎第11.5天(E11.5) PGCs的全基因组分析显示，H3K4me3/H3K27me3双价结构域在发育调控基因上高度富集，其方式与ESCs非常相似。且与周围体细胞（Soma）相比，PGCs在发育基因上富含二价（图1）。发育调节因子在E13.5开始的性分化过程中保持双价和转录抑制。