Iso-Seq助力罕见病异构体特异性表达分析

什么是Iso-Seq？

异构体测序（Isoform-Sequencing，Iso-Seq）是PacBio公司开发的基于HiFi测序技术的全长转录本高通量测序技术。该技术无需打断RNA，直接对（包含5’UTR直到3’polyA尾序列信息的）全长的cDNA序列进行测序，相比于打断后再组装的NGS技术，能够更加精确地表征整个转录组的全长异构体信息。

Iso-Seq有什么用？

让我们跟随一篇文献一起看看Iso-Seq的表现~

Arboleda-Tham综合征(ARTHS)，也称为“KAT6A综合征”，是一种罕见的由赖氨酸乙酰转移酶6A基因（KAT6A）的改变引起的单基因神经发育障碍(Neurodevelopmental Disorder，NDD)。所有ARTHS患者均表现出全面发育迟缓、智力残疾、言语和语言缺陷，更多的可变特征包括:进食困难、肌张力减退、视力问题、胃肠道问题、睡眠障碍、颅面和心脏畸形，还有大约30%的ARTHS患者同时发生癫痫和自闭症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder，ASD)。这些临床特征阐明了ARTHS的复杂图景。然而，驱动这些临床表型的分子机制仍不清晰。

一篇2023年6月发表在bioRxiv上的研究“KAT6A mutations drive transcriptional dysregulation of cell cycle and Autism risk genes in an Arboleda-Tham Syndrome cerebral organoid model”，旨在揭示在大脑发育的早期阶段，KAT6A中致病性突变的存在显著干扰转录状态的基因和基因网络，探讨KAT6A基因突变如何导致ARTHS综合症患者大脑细胞周期基因和自闭症风险基因的转录失调。

/ ARTHS在体外神经发育过程中的分子景观 /

研究人员从两名ARTHS患者及未受影响的对照组的外周血单核细胞(PBMCs)中生成了iPSC系，并从iPSC系中创建了脑类器官(Cerebral Organoids，COs) 以研究ARTHS的早期神经发育事件，使用短读长RNA-seq和长读长Iso-Seq来全面分析在COs分化的3个阶段由致病性KAT6A突变驱动的失调分子网络和生物学途径，描绘ARTHS在体外神经发育过程中改变的分子景观。

研究表明，在早期神经分化过程中，致病性KAT6A突变延迟了关键多能性和细胞周期基因的抑制。这导致循环神经前体细胞（Neuroprogenitor Cell，NPC）标记物的富集，阻止对正常神经分化至关重要的多种分子信号的启动。研究同时发现，ARTHS失调基因在ASD和癫痫风险基因中显著富集，这支持了部分ARTHS患者的临床表型。文中解释了罕见和常见NDD的趋同分子生物学基础：尽管NDD具有不同的遗传病因，但都破坏了细胞增殖、周期、迁移或分化这一系列的基因网络的转录，从而导致包括ASD在内的一系列临床神经发育表型。

总的来说，研究提出了一个ARTHS COs致病性增殖分化模型，其机制(图1)可能涉及KAT6A、细胞周期、RNA可变剪接、多能性、激活E2F、RBP(如PTBP1)和ASD风险基因之间的相互作用，为深入了解ARTHS综合症的发病机制以及发展针对该疾病的靶向治疗提供了新的线索。

图1. ARTHS COs致病性增殖分化模型

/ 长读长Iso-Seq分析鉴定ARTHS样本中的异构体特异性失调 /

值得一提的是，文章还关注这些与ARTHS显著相关的基因中是否有任何一类表现出异构体特异性的转录变化。这些转录组的细微变化很难通过短读长RNA-seq单独检测到，因为短读长测序的读取长度仅覆盖RNA转录本的一小部分。因此，研究人员同时使用了PacBio 长读长测序技术对ARTHS样本进行Iso-Seq测序，鉴定其全长转录本，并比较其与正常样本的异构体使用差异(Differential Isoform Usage，DIU)和异构体表达差异(Differential Isoform Expression，DIE)。研究发现KAT6A基因突变导致了与神经元分化和增殖有关的基因的异构体特异性失调。

图2. 与对照组相比，ARTHS患者EPHB2和CACNA1G基因的一种特定转录本异构体的表达显著减少

文中共鉴定了174个DIU基因。在这174个DIU基因中，有7个ASDR基因在ARTHS中表现出至少1个异构体的显著DIU: EPHB2、CACNA1G、SAMD11、MACROD2、CPZ、USP30和PRKN，其中两个基因:EPHB2和CACNA1G，在ARTHS中表现出一种特定转录本异构体表达的显著减少（图2）。EPHB2编码一种受发育调节的Ephrin受体，该受体调节鼻咽癌增殖、神经元分化和神经管闭合，其突变与癫痫相关。CACNA1G编码电压敏感钙通道，这是一种癫痫相关基因，调节神经元和COs的体外神经活动。并且，研究还发现，在ARTHS中显示差异异构体使用的基因中，相同的PTBP1靶基因被富集。因此，该Iso-Seq数据证实了KAT6A突变与自闭症风险基因的整体表达和异构体使用改变有关。

为什么转录组研究需要Iso-Seq？

已有研究表明，同一基因不同的转录异构体可能发挥截然不同甚至相反的功能。传统转录组测序都是采用短读长测序完成，由于读长较短，测序之前要先进行片段化，因此只能捕获分子端部的信息，测序数据只能表征基因的表达水平，缺少可能对疾病或生物功能十分关键的转录本异构体多样性信息。

Iso-seq可以直接测得RNA的全长转录本，无需组装即可表征转录组的完整多样性，准确鉴定转录本异构体。相比于传统的短读长RNA-Seq，Iso-Seq具有以下优势：

• 发现可变起始位点和终止位点，检测可变多聚腺苷化

• 揭示复杂可变剪接、融合事件以及转录通读

• 鉴定等位基因特异性异构体

HiFi测序以及其衍生的Iso-Seq测序在生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域都具有重要的应用价值，可以帮助科学家更好地理解基因表达和调控机制，为疾病的诊断和治疗提供更准确、个性化的信息和指导。如果您感兴趣，就与我们联系吧~