看LUNA-FX7™如何助力CAR-T细胞治疗？

背景介绍

CAR-T

CAR-T疗法就是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，英文全称Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy。这是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。

CAR-T疗法是个体化免疫疗法和基因疗法的结合。CAR-T细胞是一种“活的”药物，由患者自身分离和改造的T细胞。自从2018年FDA首次批准后，CAR-T疗法在血液肿瘤病患者的缓解率达到80%，和所有获得性免疫细胞疗法一样，自体或异体CAR-T细胞的生产是一个复杂的要求严格遵守法规和QA/QC准则的生物过程。为了确保最终产品的安全、质量和功效，在产品开发和生物工艺流程中，细胞健康和活力必须在整个过程中进行评估和监测。

LUNA-FX7应用

在这里，我们展示了LUNA-FX7™双荧光自动细胞计数仪如何在CAR-T细胞生产的关键步骤中监测和评估细胞健康状况的，包括：1.源材料收集，2.白细胞分离，3.分离/活化，4.CAR-T细胞增殖，5.生产。

韩国库罗塞尔公司是一家领先的研发创新抗癌免疫疗法的公司，提供了CAR-T细胞生产每个阶段两个随机的样本数据。使用LUNA-FX7™在荧光细胞计数模式下使用核酸染料染色吖啶橙和碘化丙啶(AO/PI, Cat# F23001)进行细胞计数。简而言之，每次计数，将2μl的AO/PI溶液与18 μl细胞混合后，装入2、3或8通道计数板中，自动对焦并进行计数。对于最终的浓度测定，使用LUNA™1通道计数板(Cat# L72011)进行分析，样品体积为5.1 μ l(是大多数细胞计数仪计数体积的10倍)。

表1：荧光细胞计数模式下CAR-T细胞的分析参数

• 全血中白细胞浓度、活性检测

初次采血后，取白细胞前，用1X PBS以1:100稀释细胞，在LUNA-FX7™中进行细胞计数和活力检测。虽然白细胞(WBC)只占全血细胞数量的2%的比例，图1显示出LUNA-FX7™仍然可以在异质细胞群中轻松区分出有核细胞（WBC)和无核细胞(即RBC)。

图1：全血WBC的细胞浓度和活力。在进行白细胞分离之前，将全血样本用PBS 1:100稀释，AO/PI染色，并进行计数。

A:明场 (BF)、绿色通道(GF)、红色通道(RF); B:BF/GF/RF叠加并加Tag，可区分有核/无核细胞，活细胞/死细胞;
C:GF/RF叠加并加Tag可区分活细胞/死细胞; D:1/100稀释血液后的白细胞总数和活力。

• 白细胞分离后浓度、活性检测

白细胞分离是从全血中分离白细胞的过程。图2显示了两种不同样本的质控。两种样品中均未见红细胞，但仍可观察到一些细胞碎片。LUNA-FX7™可以轻松区分有核细胞和无核细胞或非细胞碎片，最大限度地减少计数错误的可能性。

图2：白细胞分离后细胞浓度和活力。

白细胞分离后计数的WBC样本，A:BF, GF, RF原始图像,B:FL标记图像,
C:放大图像,对两个样品进行评估，并绘制的细胞浓度D和活力E。

• T细胞分离和激活后检测

在白细胞分离后，T细胞被进一步分离，然后被激活，产生一个同质的T细胞群。在这个阶段，样品质量有明显的差异(图3)。

图3：分离和活化后的细胞活力和浓度。

T细胞在分离和激活后计数，A:BF、GF和RF原始图像，B:FL标记图像，C:放大图像，
D:假阳性碎片可以通过尺寸设置除去。对两个样本进行评估并绘制细胞浓度和存活率图(E, F)。

• CARs表达后的T细胞检测

分离和激活的T细胞通过逆转录病毒诱导产生嵌合抗原受体(CARs)。转染后，新产生的CAR-T细胞在体外扩增增殖。图4显示了扩增增殖后的CAR-T细胞数量和细胞活性。

图4：CAR-T细胞扩增后的细胞浓度和活力。

细胞样本原始图像A、标记图像 (B, C)和细胞浓度和活力(D, E)。

• CAR-T细胞产品的检测

增殖后的CAR-T细胞被冷冻保存并评估合适的剂量。图5显示了两个不同细胞样品的活性和浓度。

图5：CAR-T细胞最终产品的细胞浓度和活性。 

低活性细胞样品(A)和高活性细胞样品(B)的Tag图像以及相应的细胞浓度和活力结果(C, D)。

结论

从最初的主要源材料收集到最终的剂量确定，LUNA-FX7™准确和灵活的在整个CAR-T细胞生产过程中监测细胞数量和活力状况。此外，结合预先设置的验证计数板、内部QC软件以及符合21 CFR Part 11法规的CountWire软件一起使用，确保严格的质量控制且满足监管规则的要求。

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参考文献：

1.Poorebrahim M, Sadeghi S, Fakhr E, et al. Production of CAR T-cells by GMP-grade lentiviral vectors: latest advances and future prospects. Crit Rev Clin Lab Sci. 2019;56(6):393-419. doi:10.1080/10408363.2019.1633512

2.Zhang C, Liu J, Zhong JF, Zhang X. Engineering CAR-T cells. Biomark Res. 2017;5:22. Published 2017 Jun 24.doi:10.1186/s40364-017-0102-y