如何通过细胞能量代谢分析 评估化学物的线粒体毒性（环评/毒理分析）:原理及实战应用篇

深入浅出地解释了通过细胞能量代谢分析 评估化学物的线粒体毒性的检测原理，配合地表水样品和各种有机化学物的检测实例，怎样从一条河的两个采样点分析结果中推测出两点之间可能有一条支流带入了新的污染

前言
  无论是吃穿用住行，人们日常使用的化学品有成千上万种，我们对环境中可能接触到各种物质的毒性信息的了解非常有限。体外生物检测可以增强对环境样品中化学物质的生物活性及其潜在环境影响的了解，同时还可以对它们进行优先级排序，以便于监管。此外，体外检测越来越多地用于毒理学检测，以补充多生物体和全生物体检测。与传统检测相比，体外检测更经济、更省时，为风险评估研究和常规环境监测提供了极大的优势。

  线粒体在真核生物的细胞生理学功能中发挥着重要作用，负责大部分细胞能量的产生。我们知道化学物可通过3种方式干扰线粒体的能量产生：
(1) 干扰三磷酸腺苷 (ATP) 合酶；
(2) 使线粒体内外膜解偶联，从而干扰产生 ATP 所需的质子梯度；
(3) 抑制产生电子传递链电化学梯度的蛋白质复合物（图 1）。

  本文以HepG2细胞为例介绍了一种体外检测工作流程，通过安捷伦Seahorse XF细胞能量代谢分析来鉴定各种化学物（如除草剂、杀菌剂、抗微生物剂等）、或者环境污染物（如环评中的地表水、废水处理后样品）对细胞代谢功能的生物学影响。这种无标记分析检测方法能够以96孔板形式、实时自动检测活细胞耗氧率OCR——这是线粒体呼吸、糖酵解和ATP产生速率的关键指标。使用细胞检测法来测定化学暴露对线粒体的影响已经过爱尔兰环保局验证。同样，美国国家环保局使用高分辨液相色谱/四极杆飞行时间(LC/Q-TOF) 技术，验证了基于Seahorse XF的线粒体毒性检测化学物质风险评估的非靶向分析方法。Seahorse XF细胞能量代谢分析可以区分产生线粒体毒性的3种作用模式 (MOA)，如图 1 所示。

实验分为4个时间段，如图2所示
第 1 时间段：通过3个测量周期测定基础呼吸。每个测量周期包括3分钟的细胞OCR测定和3分钟混合（通过上下移动探针实现）；
第 2 时间段：添加寡霉素（一种ATP合酶抑制剂），进行9个周期的OCR测定，对应的孵育时间为54分钟。孵育时间越长有助于提高ATP合酶抑制剂的检测可靠性，并确保细胞有足够的时间摄取这些物质。
第 3 时间段：添加80 μmol/L解偶联剂 2,4-二硝基苯酚(2,4-DNP)（使OCR达到最大值的 95%），进行3个周期的 OCR 测定。
第 4 时间段：添加0.5 μmol/L 鱼藤酮和抗霉素 A(Rot/AA)，完全抑制电子传递链，进行3个周期的 OCR 测定。

在以下工作流程中，分别用待测样品替换一种参比化学物（寡霉素、2,4-DNP 或 Rot/AA），以考察待测化学物或环境样品是否激活了相应的作用模式。在同一块96孔板中检测不同稀释倍数下的阳性对照、阴性对照和样品，建议每个浓度一式三份平行对照。图2仅显示一条曲线（即，一个孔的结果）。

流程1 抑制 ATP 合酶

如图 3A所示，在每个实验中，在第 1 时间段进行了3个周期的基础呼吸测定。为了评估对ATP合酶的抑制作用，将 2 µmol/L 三丁基锡 (TBT)、阴性对照（安捷伦 Seahorse XF检测液，抑制率为 0%）和阳性对照 1 µmol/L 寡霉素平行添加到细胞中。如图 3A 所示，ATP合酶抑制的OCR动态范围定义为：添加 Seahorse XF 检测液对细胞的抑制为 0%，添加 1 µmol/L寡霉素对细胞的抑制为 100%。由于对电子传递链的抑制同样会降低 OCR，因此通过随后添加 80 µmol/L 2,4-DNP 来评估对 ATP 合酶的抑制效应的特异性。如果暴露于样品的细胞在第 3 时间段中OCR 的增加程度没有达到添加 80 µmol/L 2,4-DNP 时观察到的增加程度，则可以得出结论：样品中的化合物抑制的是电子传递链，而不是抑制 ATP 合酶。如果干扰了电子传递链，则无法建立电化学梯度，因此无法解偶联。如图 3A 第 2 时间段所示，TBT 似乎还抑制了电子传递链。∆OCRATP 合成抑制 使用公式 3 计算，ATP 合成抑制比值使用公式 1 计算。然后，通过公式 2 拟合 ∆OCRATP 合成抑制 与ATP 合酶抑制剂浓度，得出浓度-响应曲线（图 3B）。

流程 2：氧化磷酸化解偶联
  为了检测线粒体质子梯度解偶联效应，在第 1 时间段测量了3个周期的基础呼吸速率后，通过添加 1 µmol/L 寡霉素（100% 抑制）来降低 OCR。第 2 时间段增加了OCR 抑制的动态范围（图 4A）。在第 3 时间段，将 80 µmol/L 2,4-DNP 添加到阳性对照孔中，将Seahorse XF 检测液添加到阴性对照孔中，将样品添加到样品孔中，并在 54 分钟内进行 9 个周期的 OCR 测定。同时添加 80 µmol/L 2,4-DNP，确定了效应上限水平（阳性对照，黑线），添加培养基确定了无效应水平（阴性对照，绿线），如图 4A 所示。在第 4 时间段，添加 0.5 µmol/L Rot/AA，并进行 3 个周期的 OCR 测定。羰基氰-对-三氟甲氧基苯腙 (FCCP) 或2,4-DNP 可以使质子通过膜屏障而不产生ATP，从而解偶联质子梯度。尽管本实验中使用 2,4-DNP 作为参比解偶联剂，但FCCP（安捷伦 Seahorse XF 细胞线粒体压力测试试剂盒中有提供）是一种广受认可的替代品，可用于该工作流程。
使用与之前描述的相同类型的实验对解偶联效应进行定量，但如图 4A 所示，用样品取代阳性对照解偶联剂 2,4-DNP。使用公式 4 计算 ∆OCR解偶联，并使用常用方法计算线粒体膜解偶联比值。图 4B 显示了典型解偶联剂的浓度-响应曲线，以及得出的 EC50。由于最高浓度会导致信号猝灭，因此可以选择评估低效应水平的线性浓度-响应曲线，。

流程 3：抑制电子传递链
使用鱼藤酮和抗霉素 A (Rot/AA) 的混合物作为参比化合物来破坏电子传递链。为了测量电子传递链抑制效应，在测量了基础呼吸速率后向细胞中添加 1 µmol/L 寡霉素，以确保添加样品后 OCR 的任何下降都是由 ATP 合酶抑制引起的（第 2 时间段）。3 个测量周期后，添加 80 µmol/L 2,4-DNP 以提高 OCR，从而增加动态范围。然后再额外进行 3 个周期的 OCR 测定（第 3 时间段）。在第 4 时间段中，将细胞暴露于样品、0.5 µmol/L Rot/AA或 Seahorse XF 检测液（图 5A）。添加Rot/AA 后引起的 OCR 降低代表 100% 电子传递链抑制效应（阳性对照，图 5A 中的黑线），添加检测液后的 OCR 代表无抑制效应（阴性对照，图 5A 中向下的空三角形）。使用公式 5 计算 ∆OCR电子传递链抑制，并计算电子传递链抑制比值，得出图 5B 所示的浓度-效应曲线（以嘧菌酯为例）。

实战应用一：评估化学物（除草剂、杀菌剂等农药）线粒体毒性
评估的样品中的化合物是地表水中常见的受监管的环境污染物，即除草剂溴苯腈，以及杀菌剂嘧菌酯和唑菌胺酯，详细信息请参阅 Müller 等人[1] 的文章。表 1 汇总了所测试的化学物质在不同浓度下对 OCRs 的影响。从 CRC 线性部分确定的 EC10 值在从 S 型对数 CRC 推导出的 EC10 的 95% 置信区间内。低标准偏差表明 5 次独立的重复具有出色的重现性，证实线性 CRC 评估是一种合适的方法。溴苯腈、2,4-DNP、嘧菌酯和唑菌胺酯获得的结果显示出高精密度和重现性，证实使用 Seahorse XFe96 分析仪开展的实验适用于对各种化学物质进行评估。

TBT 等有机锡化合物广泛用作抗微生物剂，特别是用作船舶的防污涂料。它们以多种方式干扰线粒体中的氧化磷酸化，并抑制电子传递、解偶联线粒体膜，以及抑制 ATP 合酶。使用工作流程1 测试 TBT 相对于 1 µmol/L寡霉素的 ATP 合酶抑制效应（图 6A，左侧 Y 轴，红色）。当浓度高于 2 µmol/L时，似乎达到了最大效应水平的 50% 左右，当浓度进一步增加时，未超过该效应水平。如果采用工作流程 3 测试 TBT，还观察到对电子传递链的明显抑制效应（图 6A，右侧 Y 轴，蓝色）。如果直接比较 ATP 合酶和电子传递链抑制效应的浓度-响应曲线（图 6A），它们具有相同的形状，在较低效应水平下呈 S 型曲线，而当 TBT 高于 2 µmol/L 时出现平台期。还使用工作流程 2 测试了 TBT 的解偶联活性。OCR 比值解偶联 以浓度依赖性方式下降（图 6B 中的右侧 Y 轴，蓝绿色数据点）。即使在已经达到 OCR 比值 ATP 合酶抑制 平台期 (50%) 的 TBT 浓度下，OCR 比值解偶联仍随着 TBT 浓度的增加而继续降低TBT 的示例表明，可以使用不同的 OCR测量工作流程来区分解偶联和电子传递链抑制效应，但无法明确指出是 ATP 合酶还是电子传递链受到抑制。

实战应用二：在环评样品中的应用
  检测来自德国阿默河 (Ammer River) 的水样，使用固相萃取 (SPE) 提取。样品的相对富集系数 (REF) 通过公式 6计算得出，即固相萃取提取和浓缩步骤中的富集系数(EF)与生物测定中样品的剂量系数(DF)的比值。富集系数可使用公式 7计算得出，剂量系数可使用公式 8 计算得出。大多数提取物显示无活性，但一种提取物（水提取物 A，图 7A）显示出较低的解偶联活性，但没有其他效应。由于效应未超过浓度的 30%，响应曲线呈线性，推导出 EC10。解偶联效应的 EC10 的 REF 为97.9 ±12.4 L水/L生物测定，这意味着必须将水样浓缩近 100 倍才能触发 10% 的效应。另一种水提取物的 OCR 比值解偶联 显示无活性，但 OCR 比值电子传递链抑制 显示出明显的线性浓度-响应曲线（水提取物 B，图 7B）。同样，样品必须经过富集才能显示出效应。从浓度-响应曲线的线性部分得出的电子传递链抑制效应的 EC10 的REF 为 9.3 ±1.8，即样品必须富集 9.3 倍才能达到 10% 的效应。这是一个较低但不可忽略的效应。

具体操作步骤略，请索取原文

结论：Seahorse XFe96分析仪OCR工作流程适用于鉴定环境水基质的线粒体毒性效应。通过已知线粒体毒性机制的各个化学物质的分析结果验证了该工作流程。阿默河样品的分析结果表明，该工作流程能够识别出采样点 1 样品的解偶联效应和采样点 2 样品的电子传递链抑制效应。针对这一结果的一种解释是，两个位点之间的一条支流引入了一种可抑制电子传递链的杀菌剂。该结论必须通过化学分析来证实。总体而言，使用Seahorse XFe96 分析仪的高通量 EDA 提供了一种快速、经济高效的工具，可以帮助研究人员更好地了解环境样品中存在的化学物质及其生物活性。

本文提出了3种实验设计来检测和定量分析样品（化学物质或水提取物）对 HepG2 细胞耗氧率 (OCR) 的影响，以区分 3 种不同的线粒体毒性机制：抑制 ATP 合酶、破坏电子传递链和质子梯度解偶联。将得到的 OCR时间曲线用于创建所有 3 个终点的浓度-响应曲线，并推导出达到强效 ATP 合酶抑制剂、电子传递链抑制剂或解偶联剂所引起的最大效应的 10% 所需的浓度。本文评估了该工作流程对已知线粒体毒性机制的环境污染物的适用性，包括：除草剂溴苯腈、杀菌剂嘧菌酯和唑菌胺酯，以及抗微生物剂三丁基锡，表明工作流程能够确认所测试污染物的主要毒性模式。对废水处理厂下游的河水样品进行测试结果揭示真实地表水样品中由于解偶联和电子传递链抑制作用而产生的线粒体抑制效应。

推荐：略