蛋白质组学如何搭上空间时代快车

蛋白质是所有细胞的功能性分子，并且是所有生物过程的效应产物。蛋白质的空间表达对于确定蛋白质在组织中的准确定位和功能至关重要，其可随着细胞类型、细胞周期进展、疾病状态和诊疗方法的变化而改变。因此，空间蛋白质组学可以用来研究疾病相关的蛋白质空间表达谱变化，为寻找生物标志物和开发新的诊疗方法提供全新的视角。近年来，空间蛋白质组学研究在微环境与疾病发展、机制与药物靶点、器官结构异质性和组织器官空间图谱等方面取得了突出的进展。2022年，科技部发布国家重点研发计划“生物大分子与微生物组”重点专项，明确了空间背景下的蛋白质组学技术对组织微环境研究的重要价值。

空间蛋白质组学有两种主要的实验方法：1、高通量成像以可视化细胞内或感兴趣的隔室内的蛋白质（分辨率高，但蛋白检测种类有限）；2、激光显微切割(LMD)分离特定区域的组织或细胞下游对接质谱(MS)技术鉴定样品中所有蛋白质的丰度、种类或修饰。

今天给大家介绍的是LMD+MS的蛋白组学研究方法。该方法可以在可视化状态下有目的性的选择并捕获特定位置的细胞或组织区域，保留了其空间位置信息，后续经过蛋白提取、酶解和纯化等步骤生成符合质谱分析的肽段，鉴定样品中的蛋白丰度、种类和修饰等信息，表征组织的空间蛋白表达特征。该方法的关键在于目标组织区域的精准捕获和微量样品的处理。

基因有限公司的空间组学方案针对以上关键步骤，将MMI CellCut激光显微切割系统与Covaris AFA聚焦超声系统结合，推出了空间蛋白组学研究方案，对目标组织或细胞进行精准切割和收集，后续对接聚焦式超声技术匀浆微量的组织或细胞，充分释放蛋白质，有利于增加蛋白质谱鉴定出的蛋白质复杂度，提高蛋白组学研究效率。

空间蛋白组学方案

蛋白质谱前组织制备流程图（S-Trap法）

✓ 激光显微切割分离组织中的均质细胞

✓ 蛋白提取试剂结合Covaris AFA聚焦超声充分释放微量样品中的蛋白质 

✓ 蛋白还原烷基化

✓ SP3磁珠/S-Trap柱纯化蛋白，酶解成肽段

✓ 质谱分析

MMI CellCut激光显微切割平台特点

1、三明治式样本制备，使样本被保护在膜片(MembraneSlide）与载玻片之间，避免环境中的灰尘或其他杂质污染以及酶等对RNA或蛋白的破坏。同时使得样本在切割时不直接接触激光产生热损伤。

2、精细切割，在切割过程中除了环境的污染会影响实验外，切割技术的精细程度也同样地决定实验结果的优劣，粗糙的切割会对切割路径周边的部位造成损坏，破坏样品的完整性。MMI CellCut激光显微切割系统采用激光静载物台动的切割方式，切割时激光光斑标准正圆形，能量集中，切割线窄。载物台步进精度0.15微米，可切割单个细胞甚至更加微小的细胞亚单位比如染色体。100x油镜下，切割线宽度只有0.3微米。

3、主动粘附收集样本，MMI CellCut激光显微切割系统采用主动粘附收集技术，收集管盖内有有机硅填充，与PET材质的膜之间有一定的黏性。当切割完成后，收集管盖主动降下将切割下来的单细胞或者组织区域粘走收集。该种收集方式不易受到空气静电或者气流等的影响，可保证高的收集效率。

4、样本收集质控，MMI CellCut可以对切割前后的组织区域以及管盖上的样本进行成像，对切割是否为所选区域、是否成功切割、是否成功采集、采集是否完整多个环节进行质控，进一步保证切割和收集的成功率。

5、样本采集量控技术PTP（Predefined Target Positioning），MMI该项设计对收集管盖做了区域的预划分，在收集时以中心1号位为首份样本的粘附位置，后面切割下来的样本将以此开始，逆时针方向依次有序排布。这种方式一方面可以有效利用收集管盖的有限空间，另外一方面可以便于对切割收集后的样本进行量控，自动统计此次切割共收集到多少份样本。如图所示，一个管盖收集到了大约300个精子细胞。

6、非染色切片切割。切片染色可以帮助实验人员更好地挑选目标区域，但染色过程可能会影响生物大分子活性， MMI CellCut的非染色切片切割功能很好地解决了这一问题。如下图，可根据每张连续切片的整体形态进行坐标定位，选择其中一张切片进行染色并进行ROI圈选，软件自动将ROI区域印射至非染色切片上进行目标区域的切割。

7、适用于多种样本类型。MMI CellCut激光显微切割系统适用的样本包括新鲜冰冻切片、FFPE样本、存档片、涂片等或者培养的贴壁活细胞。

应用案例一

2020年Jeremy A. Herrera等人在Clinical Proteomics上发表题为“Laser capture microdissection coupled mass spectrometry (LCM-MS) for spatially resolved analysis of formalin-fixed and stained human lung tissues”的文章。使用MMI CellCut 激光显微切割系统对5μm H&E染色人肺FFPE切片进行切割，结合Covaris AFA聚焦式超声和LC-MS用于低起始量样本的蛋白组学分析。

MMI CellCut激光显微切割技术从H&E染色的人肺FFPE样本中切割出低至0.0125mm3的肺血管和邻近的肺泡，经5%SDS+热处理+Covaris LE220-Plus高通量聚焦式超声系统匀浆后，显著提高蛋白提取得率。在保留空间位置信息的前提下通过质谱(MS)分析方法比较了人肺血管以及肺泡中总蛋白和胞外基质蛋白(ECM)的表达差异。该优化方案提高了蛋白质谱检测灵敏度、增加了鉴定出的蛋白种类，可为基于激光显微切割技术的空间蛋白组学研究提供必要的方法学指导，有望针对各种病理学的复杂组织进行组学图谱的研究。

a图为激光显微切割的正常人肺部的均质肺泡和血管中质谱鉴定出的所有蛋白数量，以及两种组织单独或共有的蛋白表达种类；b图为胞外基质蛋白数量。c图为在肺泡和血管中特异性表达的基因。

应用案例二

2018年Yeoun Jin Kim等发表在J Proteome Res上题为“Data-independent acquisition mass spectrometry to quantify protein levels in FFPE tumor biopsies for molecular diagnostics”的文章中，使用MMI CellCut 激光显微切割系统对12位肠胃癌患者活检组织FFPE样本进行切割，处理样本后使用DIA质谱方法定量肿瘤活检FFPE样本蛋白水平用于分子诊断。

12 份活检表达了精选数据库癌症基因组解释器 (CGI) 中列出的 201 个非冗余癌症生物标志物中的 40 个。此外，在检测到的蛋白质中，有 131 个是 FDA 批准的治疗目标。

DIA-MS与激光显微切割技术相结合，保证了样本均质性，实现了良好的覆盖深度(蛋白拷贝数达到5个数量级)。基于 DIA-MS 的临床 FFPE 肿瘤活检分析代表了一种有吸引力的诊断方法，将可靠的定量与广泛的蛋白质组覆盖范围相结合。

更多空间组学应用

• 切割捕获均质前列腺肿瘤细胞

• 切割捕获恒河猴舌头味蕾细胞

• 切割捕获小鼠内侧神经嵴细胞

• 切割捕获小鼠脑冰冻切片海马CA2区细胞

参考文献：

1. Herrera et al. Laser capture microdissection coupled mass spectrometry (LCM-MS) for spatially resolved analysis of formalin-fixed and stained human lung tissues. Clin Proteom (2020, 17:24)

2. Yeoum, et al. Data-independent acquisition mass spectrometry to quantify protein levels in FFPE tumor biopsies for molecular diagnostics. J Proteome Res. 2019.18(1): 426-435

德国Molecular Machine & Industries (MMI)是专门致力于将显微操作技术与高精度激光技术相结合应用于生命科学领域的一家专业公司，其标志性产品MMI CellCut激光显微切割系统和CellEctor单细胞分选系统成为目前世界上性能优异的样本处理系统。基因有限公司作为MMI产品中国区合作伙伴，可为感兴趣的客户提供专业的产品咨询、技术答疑及联系试用等。