CRISPR核酸检测新应用：MPXV-CRISPR诊断试纸条高度准确且“比任何其他方法更快”

《柳叶刀微生物》新发表的一篇研究介绍了澳大利亚研究人员为应对猴痘病毒(MPXV)的全球爆发，利用CRISPR技术开发的澳大利亚首个MPXV-CRISPR诊断工具。试纸条设计便携且成本低，更适合即场检测要求，将来有望成为核酸检测的补充和替代

　　

在《The Lancet Microbe》期刊上发表的一项合作研究中，由Peter Doherty感染与免疫研究所(Doherty研究所)和WEHI (Walter and Eliza Hall医学研究所)领导的科学家团队介绍了MPXV-CRISPR——一种强大的诊断工具，能够在临床样本中检测MPXV，具有高度的准确性，并且由于CRISPR技术的力量，其速度比任何其他方法都要快。这是澳大利亚第一个基于CRISPR的诊断方法，专门针对MPXV中发现的基因序列。

研究背景解读

Mpox(以前称为猴痘)是由猴痘病毒(MPXV)引起的人畜共患疾病。MPXV是一种大的双链DNA病毒(约197 kb)，属于正痘病毒属（Orthopoxvirus），“同门兄弟”还包括天花病毒(variola)。自2022年5月初以来，已有110多个国家报告了超过8.5万例病例。Mpox病例主要报告在男男性行为者中，也有少数妇女和婴儿病例报告。2022年7月23日世卫组织宣布mpox为国际关注的突发公共卫生事件，2023年5月11日取消，目前大多数国家的病毒传播仍保持在低水平。mpox的爆炸性出现，和天花疫苗“谢幕”使得年轻一代普遍缺少对此类病毒免疫力的现实，突出表明需要持续保持警惕和监测MPXV，以防止进一步的大规模疫情。

除疫苗接种外，快速发现和分离病例对控制mpox的公共卫生至关重要。传统检测技术的“金标准”qPCR对设备（需要变性、退火和延伸步骤），场地（防污染）和人员（操作技术），样本数量（批量检测）要求较高；测序的要求和成本之高更不用提，难以满足“即时现场检测”要求，不难想象，COVID-19疫情推动了一系列即场检测(PoCT，point-of-care test，)的开发，其中包括使用CRISPR和CRISPR相关蛋白(Cas)技术。

以基因组编辑能力而闻名的CRISPR技术，亦可用于设计功能强大且高度敏感的诊断工具。

早在2017左右，CRISPR技术的领头羊——Jennifer Doudna和张锋先后报告过利用Cas12和Cas13家族具备collateral cleavage能力（或称为cleavage in trans）成功设计了基于CRISPR的核酸分子检测方法。简单来说，Cas-crRNA复合物识别并结合底物后，不仅能切割底物，还能切割游离在环境内的任意底物，这种能力被称为反式切割（collateral cleavage）。检测方法的基本策略是利用等温核酸扩增技术使底物浓度增加，再利用Cas复合物识别并结合底物后的反式切割能力，切割报告分子，使荧光基团游离而被检测到。等温核酸扩增技术与CRISPR-Cas介导的靶点识别的联合具有高灵敏度和特异性，相对简单便捷（RPA只需37℃）、耗时短、价格低廉，可能是更适合即场检测的方法，为包括mpox在内的感染性疾病的低复杂性即场检测提供了机会。

primer-gRNA设计

这项概念验证研究采用一种基于CRISPR- Cas12的便携式等温扩增检测MPXV的方法。墨尔本大学的研究人员利用从美国国家生物技术信息中心(NCBI)下载的523个MPXV基因组数据库，来设计重组酶聚合酶扩增(RPA)引物和CRISPR gRNA (CRISPR guide RNA)：首先鉴定了MPXV中高度保守的基因(存在于≥90%的基因组中)，并进行了个体比对，将其用作引物和gRNA设计的靶点；另外再采用基于k-mer的方法来鉴定MPXV独有的22-mers到24-mers，并将其与TTTV原间隔区相邻的基序位点作为gRNA结合位点，引物随后被设计在该区域的两侧。根据计算机模拟结果(灵敏度≥90%，特异度为100%)，共得到22组引物-gRNA组合。随后使用基于荧光的读取结果来评估分析灵敏度和特异性，筛选出3个产生最强信号的组。进一步分析显示最高灵敏度(LOD为1个基因组拷贝/ μL)的引物-gRNA组合经过灵敏度和特异性分析，对523个MPXV基因组的识别能力分析，最终入选。

横向流试纸条设计

MPXV-CRISPR检测包括用引物对样本进行20分钟/39℃ 等温扩增，20分钟/37℃的CRISPR试剂反应，以及5分钟的横向流试纸条（lateral flow strip）检测。

试纸条的设计跟张峰的SHERLOCK v2版的lateral flow strip设计相似，他们采用了两端连有发光基团FAM和生物素biotin的报告分子。在室温下将25 μL MPXV-CRISPR检测试剂加入75 μL HybriDetect检测缓冲液中。将横向流试纸条浸入总体积中5分钟后进行读数。

带有抗FITC抗体的金纳米颗粒预置于试纸条的样品上，生物素配体固定于质控线（control line），抗兔抗体固定于检测线（Test line）。将样品反应液滴在样品垫上，报告分子的FAM部分与抗FITC抗体的金纳米颗粒结合，并在毛细作用下样品向前流动，当目标DNA不存在的情况下(阴性检测)完整的报告分子的生物素部分被质控线的生物素配体俘获，质控线显色，检测线不显色；而在目标DNA存在的情况下(阳性检测)Cas复合物结合靶标并切割靶点，连带发生反式切割将报告分子中的FAM和生物素切开，被切割下来的生物素部分与生物素配体结合，质控线显色，而被切割下来的FAM部分与抗FITC抗体金纳米颗粒结合继续向前，在检测线上被抗兔抗体捕获显色。

图片来自论文作者

从等温扩增到CRISPR检测结果的最佳运行时间约为45分钟，使用所选择的引物gRNA组合进行基于MPXV的重组酶聚合酶扩增和CRISPR-Cas12的检测，LOD为1拷贝/ μL，对所检测的病毒病原体具有100%的特异性。使用荧光读数对185个临床样本进行盲法一致性测试，结果灵敏度为100% (95% CI为89.3 - 100)，特异性为99.3% (95% CI为95.7-100)。试纸条在视觉和计算评估方面具有100%的灵敏度(89.3 - 100)和98.6%的特异性(94.7-100)。总体而言，试纸条结果与基于荧光的读数高度一致(185次测试中有179次，一致性为96.8%)，差异与低病毒载量样品有关。

作者的话

墨尔本大学的Soo Jen Low博士是Doherty研究所的研究官员，也是该研究的第一作者之一，他说基于CRISPR的诊断工具就像超精确的侦探，可以快速找到与特定病原体存在相关的DNA序列。“为了发挥作用，MPXV-CRISPR必须被‘编程’以识别病毒。我们使用523个MPXV基因组的数据库来精心设计“向导”，以结合我们在病毒DNA上寻找的特定部分。做到这一点对我们的诊断工具的成功至关重要，”“从本质上讲，当临床样本中存在病毒DNA时，CRISPR系统被引导到目标，随后发出信号表明病毒的存在。我们的检测方法可以达到与金标准PCR方法相当的灵敏度和精度水平，但所需时间很短。”

WEHI的研究助理、该论文的共同第一作者Matthew O 'Neill解释说，这项新技术能够提供诊断的速度是MPXV-CRISPR的突破性特征之一。“目前mpox诊断主要依赖于中心实验室环境，存在，而MPXV-CRISPR可以在45分钟内检测到病毒。”

根据世卫组织诊断检测应准确、可获得和负担得起的标准，该小组正在努力将MPXV-CRISPR改造成一种便携式设备，有朝一日可以在全国各地的医疗点部署，以便快速现场检测猴痘病毒。WEHI的高级研究官员、Doherty研究所初级实验室主任、该论文的共同资深作者Shivani Pasricha博士说，MPXV-CRISPR有可能彻底改变我们管理痘的方式，对公共卫生产生有意义的影响。“通过改善澳大利亚各地(包括资源有限的地方和偏远地区)获得快速可靠诊断的机会，这种分散的检测方法可以加快治疗速度，改善患者的预后，同时加快我们管理未来疫情的能力。”

前景

基于CRISPR的试纸条形式核酸检测具有准确性高，操作方便易于携带和保存，对设备和检测人员无需特殊要求等优点，比较适合小范围的即场检测，如果后继应用中能解决样品的快速核酸纯化和等温扩增操作、进一步缩短时间，将会是核酸检测的另一种有效补充和替代，颇有市场前景，值得重视。