Covaris AFA技术提供ChIP解决方案，助力小胶质细胞身份建立

【字体：大中小】 时间：2023年09月27日 来源：基因有限公司

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　　文章关注的是转录调节因子与基因组的结合，因此涉及到了大量的ChIP实验，包括H3K27ac、H3K4me3的ChIP-seq，SALL1、SMAD4、P300的ChIP-seq等。值得一提的是，本文中所有ChIP-seq的文库制备环节均采用Covaris E220进行。

ChIP

染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）是研究DNA和蛋白质相互作用的有力工具，因此常被研究人员用来研究转录因子、调控蛋白、修饰组蛋白等与DNA特异性结合位点，从而为探索基因的调控功能以及分子通路研究提供重要的线索。

文献解析

来自加州大学的研究人员在Nature Immunology发表了一篇题为“SALL1 enforces microglia-specific DNA binding and function of SMADs to establish microglia identity”的文章，该文通过ATAC-seq、ChIP-seq、RNA-seq、免疫染色等手段解析了小鼠小胶质细胞身份建立的机制。通过确定SALL1的基因组结合位点并利用增强子敲除(EKO)模型来检查SALL1的转录效应，揭示了SALL1在小胶质细胞中同时作为激活因子和抑制因子，并为小胶质细胞特异性基因表达所需的SALL1和SMAD4之间的功能相互作用提供了证据。文中所有ChIP-seq的前期文库制备均借助了Covaris系统来进行染色质片段化。

小胶质细胞是中枢神经系统中主要的巨噬细胞群体，是一种自我更新的卵黄囊衍生细胞，其功能包括调节大脑发育、维持神经回路和对损伤/感染的反应。Spalt-like转录因子1 (SALL1)是器官发生和小胶质细胞身份的关键调节因子。Sall1的表达依赖于TGFβ1信号传导，这是小胶质细胞分化和存活所必需的。

1. 小胶质细胞Sall1的表达受SE调控

研究人员通过染色质可及性测序(ATAC-seq)，染色质免疫共沉淀，及H3K27ac（活性增强子及启动子相关的组蛋白修饰）与转录共激活子p300的ChIP-seq(图1a)，找到了一个距离Sall1启动子约300 kb的区域，该区域被一组高水平的开放染色质H3K27ac和p300标记，符合超级增强子（super-enhancer，SE）描述的标准。利用CRISPR/ cas9介导的缺失，产生了跨越13 kb SE (EKO)的纯合子敲除小鼠(图1a，蓝色高亮部分)。通过RNA测序(RNA-seq)发现小胶质细胞中Sall1转录物的水平以增强剂剂量依赖的方式受到影响，杂合子EKO小鼠(Het EKO)中Sall1 mRNA减少50%，EKO小鼠中Sall1 mRNA完全丢失(图1c)。EKO导致小胶质细胞中Sall1位点的H3K27ac信号完全缺失。单分子荧光原位杂交显示，在EKO小胶质细胞中缺乏Sall1 mRNA的表达。Hi-C数据表明，在从WT小鼠分离的小胶质细胞中，Sall1位点高度互连，形成一个拓扑相关结构域，相比之下，这些相互作用在EKO小胶质细胞中几乎完全消失。这些结果表明，从Sall1 SE中缺失的13kb区域是建立该基因座主动调控特征所必需的。

图1. Sall1的表达受小胶质细胞特异性SE的调控

2. SALL1同时作为激活因子和抑制因子

为了将SALL1的基因组结合与其转录功能联系起来，研究人员在EKO小胶质细胞中进行ATAC-seq和H3K27ac ChIP-seq，定义了四类假定的增强子(图2):与SALL1直接激活相一致(EKO中存在SALL1, H3K27ac缺失，n = 1058)、与SALL1直接抑制相一致(EKO中存在SALL1, H3K27ac增加，n = 714)、与SALL1间接激活相一致(EKO中缺乏SALL1, H3K27ac缺失，n = 1435)、与SALL1间接抑制相一致(SALL1缺乏，H3K27ac增加，n = 2499)相一致。由此可知，SALL1在小胶质细胞中起抑制因子和激活因子的作用。

图2. 四类假定的增强子

3. SALL1和SMAD的相互作用研究

SMAD可能既控制Sall1的表达，又在小胶质细胞中作为SALL1的重要结合伙伴发挥作用。通过对分类的小胶质细胞（WT、EKO）核中的SMAD4进行ChIP-seq，研究人员证明了：SMAD4直接与Sall1超级增强子结合，是Sall1表达所必需的，这与TGFβ和SMAD同源物Dpp和Mad在果蝇翅膀中细胞特异性表达Spalt的进化保守要求一致。出乎意料的是，SALL1反过来可以促进SMAD4在小胶质细胞特异性增强子上的结合和功能，同时抑制SMAD4与在增强子敲除小胶质细胞中被不当激活的基因增强子的结合，从而增强TGFβ -SMAD信号轴的小胶质细胞特异性功能。

参考文献：

https://doi.org/10.1038/s41590-023-01528-8

ChIP小贴士

该文关注的是转录调节因子与基因组的结合，因此涉及到了大量的ChIP实验，包括H3K27ac、H3K4me3的ChIP-seq，SALL1、SMAD4、P300的ChIP-seq等。值得一提的是，本文中所有ChIP-seq的文库制备环节均采用Covaris E220进行。

Covaris是一家专注于样本前处理的公司，其独特的专利技术Covaris AFA聚焦超声可被应用于染色质片段化。因此，很多ChIP实验都会采用Covaris系统，用以提升实验的可重复性和片段的均一性。

1. Covaris可提供标准化的染色质制备和剪切方案

从甲醛的选择（16%单体新鲜甲醛）、固定时间的优化（干细胞和原代细胞2.5min和10min；其他细胞5min和10min），SDS含量（0.1%），到超声条件的摸索，Covaris可提供一系列优化建议及一站式解决方案，包含ChIP过程中涉及到的试剂及AFA系统，助您更方便快捷地进行ChIP实验的摸索和优化。

2. Covaris可提供稳定的染色质剪切结果

①可将染色质片段化为300~600bp之间，片段分布均匀，剪切无偏好，重复性高；

②温度恒定，保护蛋白抗原表位，提高IP和DNA回收率；

③非接触式处理，无交叉污染；

④高频低能的聚焦声波，以较低的能量输入获得良好的处理效果，避免传统超声能量过剩可能引起的样本处理过度及热损伤；