Covaris助力单细胞蛋白组学研究

研究背景

了解细胞异质性对理解人体正常生理活动、解决肿瘤免疫、干细胞疗法等生物学过程起着非常重要的作用。然而，由于现有定量单细胞中蛋白质水平的方法的局限性，使得蛋白质组异质性在很大程度上仍未被探索。为解决这些限制，本研究开发了一种单细胞蛋白质组学研究方法——单细胞蛋白质组学质谱法（SCoPE-MS），并验证了其基于蛋白质组学识别不同人类癌细胞类型的能力，并对小鼠胚胎干细胞（ES）中的1000多种蛋白质进行定量。相关研究“SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation”发表在《Genome Biology》上。

SCoPE-MS技术方法介绍

为了开发单细胞蛋白质组学技术SCoPE-MS，本研究需要解决两个难题：（i）如何以最小的蛋白质损失将哺乳动物细胞的蛋白质组传递到MS仪器；（ii）如何同时对单细胞样本中的肽分子进行识别和定量。

为解决第一个问题，研究人员在显微镜下手动挑选活的单细胞，然后通过Covaris S220非接触式聚焦超声的方法对细胞进行裂解，最大限度地减少样本处理过程中蛋白样本的损失；由于增加载体细胞的数量会增加多肽的鉴定率，因此本研究增加每个细胞组的样品，包括100-200个细胞载体，为多肽序列鉴定提供更多的离子；对于第二个问题，采用新颖的串联质谱标签（TMT）方法，在单细胞层面标记每个样本中的肽段，通过对肽段进行识别和定量从而进行定量蛋白组学分析。

为评估SCoPE-MS区分不同细胞类型的能力，制备了三个标记交换和交错的TMT组，其中交替使用单个Jurkat细胞和U-937细胞，在单个细胞中定量的所有767个蛋白的水平被投射到它们的主成分（PC）上，结果显示，SCoPE-MS可以根据蛋白质组识别细胞类型。同样地，为了检验和评估SCoPE-MS方法的可靠性，本研究将SCoPE-MS定量单细胞蛋白质的方法与Bulk样本定量蛋白的方法进行比对分析，其结果表明，虽然SCoPE-MS含有更多背景噪音，但其定量结果的精确度和重现度更高。

图1. 基于蛋白质组对单个癌细胞进行分类的SCoPE-MS验证。a. SCoPE-MS的原理图和工作流程；b.设计SCoPE-MS区分U-937细胞和Jurkat细胞的对照实验；c.使用图b中描述的实验中定量蛋白质的数据进行无监督主成分(PC)分析，按细胞类型对单个癌细胞的蛋白质组进行分层；d.单个U-937细胞和Jurkat细胞的蛋白水平分布表明细胞类型特异性蛋白丰度；e. 流式细胞荧光分选技术（FACS）与SCoPE-MS方法对每个单细胞中两种蛋白相对水平的定量比较结果。

结果分析

结果一 基于SCoPE-MS研究分化中的胚胎干细胞

研究人员基于SCoPE-MS方法，量化了小鼠胚胎干细胞在分化过程中的单细胞层面蛋白质表达的异质性和动态变化。为启动分化，从胚胎干细胞的培养液中去除白细胞抑制因子(LIF), 并进行悬浮培养，LIF的去除导致胚状体(EB)外胚层谱系的复杂和高度异质性分化。通过SCoPE-MS方法量化了超过1000种蛋白质，并在LIF去除后的3、5、8天对其进行相关性的分析。

图2. 鉴定胚胎干细胞分化过程中的蛋白共变异。a.去除LIF后3、5和8天细胞分化的成对蛋白相关性聚类图；b.将a图的相关矩阵之间的相似性通过相应相关向量之间的相关性分布来量化；c.核糖体蛋白(RPs)之间的所有两两Pearson相关性通过跨细胞平均计算；d.基因本体（GO）定义的功能相关蛋白集合内的Pearson相关性评估。

为评估单细胞中定量蛋白质的丰度，本研究比对了在Bulk样本中识别的不同蛋白质丰度的数量分布和单细胞样本中对应的蛋白质的分布情况。结果显示，结合SCoPE-MS和靶向质谱方法的改进，在单细胞中鉴定到的蛋白质丰度总体要高于Bulk样本，SCoPE-MS能够定量更多含量较低的蛋白质。

图3. 胚胎干细胞分化的主成分分析。a.在Bulk样本中识别的不同蛋白质丰度的数量分布和单细胞样本中对应的蛋白质的分布情况；b.主成分分析第3、5、8天的共计190个细胞的蛋白质表达差异；c.选取的3个主成分所对应的方差解释度和其他的相关信息；d, e.对第8天的细胞分别选取不同的两个维度对两类功能的相关蛋白质group的表达水平进行可视化。

结果二 单细胞蛋白质组和单细胞转录组的数据对比分析

本研究利用Klein在2015年提供的胚胎干细胞不同分化阶段的scRNA-seq数据，对mRNA的表达进行关联度分析，同时分析了mRNA和蛋白质的共变异，以及在mRNA水平共表达的基因是否也在蛋白质水平共表达。数据结果进一步有力地证实了SCoPE-MS方法的定量准确性。

图4. 胚胎干细胞分化中的mRNA和蛋白的相关性分析。a.基于胚胎干细胞不同分化阶段的scRNA-seq数据，对mRNA的表达进行关联度分析；b. 单细胞蛋白质组的关联度分析结果；c.基于图a和图b中的层次聚类结果，比较单细胞转录组和单细胞蛋白质组数据的overlap情况；d.蛋蛋白-蛋白相关性与其对应的mRNA-mRNA相关性的关联分析；e.不同功能对应的基因在mRNA和蛋白质水平表达协同性的情况。

研究结论

本研究开发了一种基于Covaris聚焦式超声样本处理系统的单细胞蛋白质组学研究方法SCoPE-MS，基于该方法能够对细胞进行分类，并探索单个哺乳动物细胞中mRNA和蛋白水平之间的关系。这是对单一哺乳动物蛋白质组学的首次尝试，表明mRNA共变甚至在单细胞中也能预测蛋白质共变。进一步确立了SCoPE-MS定量表征单细胞基因调控和基于蛋白质组对细胞类型进行分类的前景。

划重点

Covaris聚焦式超声样本处理系统是在传统超声波处理基础上的技术革新，通过球面固态超声换能器将声波聚集到样本区域，对样本进行处理。聚焦声波能够以极低的能量输入获得良好的处理效果，避免传统超声能量过剩引起的样本处理过度及热损伤，为样本处理提供高效可控、重复性优良、温度恒定及无污染的处理环境。

Covaris不同型号展示

原文链接：https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-018-1547-5

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