选择单细胞RNA测序方法，需要考虑哪些因素？

单细胞RNA测序（scRNA-seq）是近年来大热的技术，它让研究人员能够探究以往的批量细胞RNA测序无法回答的问题，其深度在过去几乎是无法想象的。随着scRNA-seq从专家实验室走向更多的实验室，研究人员现在又面临着一项新任务，那就是确定哪种方法和平台更能满足他们的需求。

本文将探讨在选择scRNA-seq方法时需要考虑的因素，包括研究内容、样本类型、待分析的细胞数量，以及所需的分辨率。

为什么选择单细胞？

批量细胞RNA测序在2005年后开始流行。然而，它测定的是整个组织内的RNA平均表达水平，因此会掩盖细胞异质性。例如，批量细胞RNA测序能够很好地区分肿瘤组织和健康组织，但无法列举浸润肿瘤的T细胞类型。

据哈佛医学院单细胞核心实验室的副主任Arpita Kulkarni介绍，随着时间的推移，其他一些技术的发展也促使人们开发出单细胞分辨率的测序技术。这些技术包括，对单个细胞中的RNA进行扩增，为测序提供足够的材料；条形码技术，让来自单个细胞的RNA或DNA都带上唯一的细胞ID以便追踪，这样就能与其他细胞混合后进行处理；体外转录技术，实现线性扩增（而不是指数扩增）；以及通量更高、成本更低的测序技术。

scRNA-seq通常从单细胞的分离和捕获开始。之后是逆转录、扩增、添加条形码和文库制备等步骤。接下来对文库进行测序并分析数据，观察哪些转录本在同一个细胞中共表达，以及表达水平如何。

有了scRNA-seq，研究人员能够探索不同细胞类型之间的基因表达变化。例如，它可以追踪胚胎的发育过程或肿瘤的进展过程。另一个重要的应用是创建高分辨率的细胞目录，也就是细胞图谱（atlas）。

考虑实验规模

在决定使用哪种平台时，实验的通量和规模是重要的考虑因素。10x Genomics公司单细胞应用的产品营销经理Angela Churchill认为：“这既包括每个样本中待分析的细胞数，又包括特定时间内需要处理的样本量。样本异质性、研究范围以及感兴趣细胞的稀有程度都会影响实验的通量。”

有些研究并不需要大规模的实验。研究人员可以使用微孔板，通过FACS分选、激光显微切割甚至移液器将几百个或几千个细胞分离到每个孔中。Kulkarni指出，“这些只需要非常简单的设备，以及大多数分子生物学实验室都有的试剂。”这些方案很经济，但工作量非常大。

对于某些问题，则需要更多的数据来解答。10x Genomics基于微流控技术的Chromium系统是高通量平台的领先者。Kulkarni表示原因有很多，包括“强大的客户支持”、“精心设计的实验方案，操作起来很简单”以及“一切都很简化”。

她指出，目前有一些技术试图通过常规的实验室设备来实现高通量，从而绕过微流控技术。具体包括Parse Biosciences的Evercode单细胞平台，它依赖连续几轮的组合条形码来标记每个细胞中的cDNA；以及Fluent Biosciences的PIP-seq，它采用以颗粒为模板的即时分液（PIP）技术，对细胞进行分液，添加条形码并开展文库制备。

它们可分析的样本数量在增加，每个样本中的细胞数量也在增加。Parse Biosciences的联合创始人兼首席技术官Charlie Roco指出，事实上，文献中的数据集平均大小呈指数级增长。因此，在选购产品时最好是挑选一款能够根据实验规模而扩展的产品。

数据质量

除了可扩展性，Roco认为数据质量是选择平台时最重要的考虑因素。“我应该使用哪个平台来继续开展我的大型项目？在设定的测序深度下，我能够检测到多少个独特的基因和转录本？我需要丢弃多少细胞，因为它们基本上被污染了，或者是双细胞（doublet）而不是单细胞。”

他还提到了环境RNA（ambient RNA），这些RNA来自单细胞悬液中的破裂细胞，可能混入捕获细胞的RNA中一起被封装，最终会错误地归于捕获细胞。Parse Biosciences的方案是洗涤细胞，因为在标记后细胞仍保持完整。

考虑灵活性

并非所有的样本类型都与标准的scRNA-seq分析兼容。例如，巨核细胞对于大多数微流控平台来说体积过大，而某些海洋生物对盐度和渗透压的要求可能会干扰下游的某些步骤。

据Kulkarni介绍，神经元组织不大适合开展活细胞实验，而脂肪组织的高脂肪含量会抑制cDNA的高效逆转录。这类组织的最佳处理方法是迅速冷冻组织，提取细胞核，然后用细胞核代替活细胞。文库制备的下游方案仍保持不变。

Parse Biosciences等平台不使用微流控技术，而是使用固定细胞，因此可以处理多种类型的样本。 “另一方面，Chromium等平台提供了多种分析产品，与各种不同的起始样本兼容，包括多聚甲醛（PFA）固定的组织和FFPE组织、新鲜/冷冻样本以及细胞悬液/细胞核，”Churchill指出。

与新鲜样本相比，使用固定样本的好处是研究人员可以收集和存储样本，在方便的时候分批处理，比如交给核心实验室处理。

未来即现在

如今，各大公司一直在开发新的单细胞产品，不仅能够接受不同的输入（起始材料），还能实现不同的输出，比如在单细胞水平上分析染色质可及性、TCR或BCR，有时还能与另一种组学分析同时进行。

Kulkarni指出：“下一波研究浪潮是开展空间分辨的单细胞测序。人们对原位单细胞测序非常感兴趣，这样就不会破坏组织的三维结果。因此，现在出现了一大批以空间分辨单细胞转录组学为重点的公司，其目标是将单细胞与表观基因组学或各种不同的多组学研究的数据相整合。”