单细胞多组学分析，目前有哪些方法可以选择？（一）

复杂的组织和生物体是由异质性的细胞组成的。过去十年，单细胞测序技术越来越多地应用于细胞异质性研究。然而，人们不再满足于单个层面的信息，而是开始采用多组学策略，对基因组、转录组、蛋白质组以及最近的基因表达空间模式等信息进行整合。这种多组学方法克服了将不同实验的单模态数据进行整合的缺点，并确定了单个细胞内的关键分子特征。

尽管第一项单细胞多组学技术在2014年才发表，但自那时起，各种各样的方法开始涌现，在测序通量、深度和覆盖度等方面不断提高。在这篇文章中，我们将介绍单细胞多组学技术的最新进展，并重点介绍同时分析单细胞的基因组、表观基因组或转录组的方法。

转录组和染色质

对同一细胞中染色质可及性和转录组的综合分析，有助于了解特定基因组区域的染色质状态与相应转录本水平的直接联系。而且，转录因子的结合是瞬时的，而染色质水平反映的表观遗传标记的变化可以持续数天或数周。因此，同时检测染色质可及性和基因表达的技术有助于剖析不同时间尺度的细胞状态。目前，科学家们已经开发出多种方法来同时分析染色质和转录组。

低通量的方法

Reyes等人开发出一种简单而高效的方法，可测定单细胞的染色质可及性和转录组¹。在裂解FACS分离出的单细胞后，他们利用oligo-dT磁珠分离poly(A)+ RNA并进行逆转录。在扩增cDNA后利用Smart-seq2方案制备RNA-seq文库。另外，利用索引PCR扩增酶切法片段化的gDNA，以制备ATAC-seq文库。

研究人员采用这种方法成功显示了三种不同免疫细胞的聚类，并将调控元件的染色质可及性与目标基因的表达联系起来。不过，与单组学scRNA-seq方法相比，这种技术的聚类性能较低。采用另一种聚类方法，或优化RNA与DNA的分离，也许能改善聚类结果。

Liu等人在2019年开发出一种名为scCAT-seq的方法²。这是一种高效的低通量方法，需要对FACS分离出的单细胞进行裂解，然后通过离心将胞质RNA与DNA分离。之后采用Smart-seq2方案制备RNA-seq文库，并利用Tn5转座酶对gDNA进行片段化，再分析染色质可及性。

作者利用这种方法成功生成了早期胚胎的第一份单细胞染色质可及性和转录组整合图谱。利用调控元件的可及性与基因表达的显著变化，他们定义了细胞特异性的调控关系，并确定了细胞特异性的主转录因子。与scATAC-seq相比，scCAT-seq提供了更多的可用片段，不过落入peak区域的可用片段比例较低，导致信噪比较低。

scDam&T-seq方法在2019年开发，可同时单细胞中的转录组和蛋白质-DNA相互作用³。它采用DamID方法，用Dam甲基转移酶和目标蛋白的融合蛋白转染细胞，导致m6A标记在gDNA的开放位点积累。通过这种方法可测定不同时间的蛋白质-DNA相互作用。之后通过FACS分离出单细胞，并利用DpnI内切酶进行消化，导致m6A位点的gDNA被片段化。随后在cDNA和gDNA上添加条形码并扩增。

Rooijers等人用scDam&T-seq方法来分析小鼠胚胎干细胞中染色质的结构。他们揭示了基因组与核纤层如何接触，以及染色质可及性与基因表达的相关性。scDam&T-seq省略了核苷酸分离和线性扩增，最大限度减少了材料损失和技术偏倚。这种方案的局限在于需要用Dam融合蛋白来转染细胞，这可能会因细胞类型不同而导致效率差异。

高通量的方法

Xing等人在2020年开发了ASTAR-seq方法⁴，它采用Fluidigm C1微流控平台来分离和裂解细胞、逆转录、片段化，最后扩增cDNA和gDNA。在扩增过程中，对cDNA进行生物素化，以便将其与gDNA分开。之后分别制备gDNA和cDNA的文库。

利用这种技术，研究人员沿红细胞分化的拟时间轨迹排列了原代细胞，并确定了负责分化进程的基因和调控元件。与scCAT-seq相比，ASTAR-seq捕获的是全细胞转录组，在文库复杂度相当的情况下，基因组比对率更高，基因检测率也更高。此外，染色质可及性数据的信噪比明显高于单模态的scATAC-seq文库。不过，ASTAR-seq需要使用Fluidigm微流控平台，这可能会限制定制分析或增加分析成本。

sci-CAR方法由华盛顿大学等机构的研究人员开发，于2018年发表在《Science》杂志上⁵。它采用组合索引策略，两轮添加条形码。第一轮发生在逆转录和片段化过程中，之后通过FACS对细胞核进行分选，并将裂解液分为两等分，加上不同的索引，分别制备cDNA和gDNA文库。

研究人员利用这种方法确定全肾原代细胞培养系统中存在的不同细胞类型，并将远端顺式调控元件（CRE）的染色质可及性与目标基因的表达变化联系起来。这种方法需要定制合成一系列索引试剂，尽管能提高通量，但也会增加成本。此外，与其他高通量技术一样，文库的复杂度不如低通量方法，尤其是染色质可及性数据。

Paired-seq方法于2019年发表，是一种超高通量的方法⁶。它利用有限稀释法获得单个孔内的单细胞，并采用基于连接的组合测序策略，添加五轮条形码。第一轮添加条形码是在逆转录和片段化过程中进行的，随后是三轮的split-and-pool条形码连接。最后一轮添加条形码是在DNA加尾过程中进行的。这种多轮添加条形码的方法大大提高了该技术的通量。

研究人员表明，Paired-seq能够鉴定成年小鼠大脑皮层的主要细胞类型，重建发育前脑的细胞谱系轨迹，并将远端的顺式调控元件与潜在的目标基因联系起来。这种方法虽然通量很高，但繁琐的条形码添加过程导致细胞核回收率较低，可能不适用于临床标本等少量或稀有的样本。

SHARE-seq也是一种高通量方法⁷，建立在Paired-seq基础上，分析成本低，表现优异。与Paired-seq一样，SHARE-seq也需要多轮添加条形码。不同的是，细胞在透化之前已固定，因此它采用SPLiT-seq策略进行文库制备。

研究人员利用SHARE-seq揭示的峰-基因关联，鉴定出调控染色质的基因组区域，这些区域在目标基因表达之前就已开放，反映了毛囊分化背景下的谱系始发机制。与其他方法相比，SHARE-seq的峰中存在更高比例的片段，且RNA文库复杂度更高。

南方科技大学的研究人员开发出一种名为ISSAAC-seq的方法，能够同时分析单细胞的染色质可及性和转录组⁸。这是第一种采用SHERRY方法制备转录组文库的单细胞多组学技术。ISSAAC-seq方法采用Tn5转座酶对染色质进行片段化，然后进行原位逆转录。之后在ISSAAC-seq反应中加入Tn5转座酶，特异性标记逆转录产生的DNA-RNA杂合链，接着进行缺口补齐和Exo I酶切消化。后续通过FACS或微流控技术分离细胞核，再进行文库扩增。

研究人员采用这种方法来研究小鼠大脑皮层，以分析少突胶质细胞成熟过程中的染色质可及性和基因表达的动态变化。ISSAAC-seq具有灵活的工作流程，既适合高通量应用，也适合低通量应用。ISSAAC-seq 的关键步骤之一是在30°C下对染色质开放区域进行标记，而不是ATAC-seq实验中常用的37°C。30°C的染色质标记不会影响ATAC-seq文库的数据质量，并显著提高了RNA-seq文库的检测质量。与sciCAR-seq、SNARE-seq和Paired-seq等方法相比，ISSAAC-seq的性能和灵敏度更高，峰中出现的ATAC片段比例特别高。

总的来说，本文介绍了分析单细胞转录组和染色质可及性的多种方法。在低通量方法中，Reyes等人开发的方法成本最低，工作流程也最简单。ASTAR-seq方法的通量更高，性价比高，但需要使用微流控平台。在高通量方法中，Paired-seq的通量最高，但SHARE-seq和ISSAAC-seq的性能更佳。希望这些信息能够帮助您挑选到最适合的方法。

参考文献

1. Reyes, M., Billman, K., Hacohen, N., and Blainey, P. C. (2019b). Simultaneous Profiling of Gene Expression and Chromatin Accessibility in Single Cells. Adv. Biosys. 3 (11), 1900065. doi:10.1002/adbi.201900065

2. Liu, L., Liu, C., Quintero, A., Wu, L., Yuan, Y., Wang, M., et al. (2019). Deconvolution of Single-Cell Multiomics Layers Reveals Regulatory Heterogeneity. Nat. Commun. 10 (1), 470. doi:10.1038/s41467-018-08205-7

3. Rooijers, K., Markodimitraki, C. M., Rang, F. J., de Vries, S. S., Chialastri, A., de Luca, K. L., et al. (2019). Simultaneous Quantification of Protein-DNA Contacts and Transcriptomes in Single Cells. Nat. Biotechnol. 37 (7), 766–772. doi:10.1038/s41587-019-0150-y

4. Xing, Q. R., Farran, C. A. E., Zeng, Y. Y., Yi, Y., Warrier, T., Gautam, P., et al. (2020). Parallel Bimodal Single-Cell Sequencing of Transcriptome and Chromatin Accessibility. Genome Res. 30 (7), 1027–1039. doi:10.1101/gr.257840.119

5. Cao, J., Cusanovich, D. A., Ramani, V., Aghamirzaie, D., Pliner, H. A., Hill, A. J., et al. (2018). Joint Profiling of Chromatin Accessibility and Gene Expression in Thousands of Single Cells. Science 361 (6409), 1380–1385. doi:10.1126/science.aau0730

6. Zhu, C., Yu, M., Huang, H., Juric, I., Abnousi, A., Hu, R., et al. (2019). An Ultra High-Throughput Method for Single-Cell Joint Analysis of Open Chromatin and Transcriptome. Nat. Struct. Mol. Biol. 26 (11), 1063–1070. doi:10.1038/s41594-019-0323-x

7. Ma, S., Zhang, B., LaFave, L. M., Earl, A. S., Chiang, Z., Hu, Y., et al. (2020). Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell 183 (4), 1103–1116.e20. doi:10.1016/j.cell.2020.09.056

8. Xu, W., Yang, W., Zhang, Y. et al. ISSAAC-seq enables sensitive and flexible multimodal profiling of chromatin accessibility and gene expression in single cells. Nat Methods 19, 1243–1249 (2022). https://doi.org/10.1038/s41592-022-01601-4