在微滴中实现快速、高通量的抗生素耐药菌筛选

抗生素耐药细菌分离方法

在过去二十年中，抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance，AMR）已成为全球公共卫生的严重威胁。预计到2050年，AMR的持续上升预计将导致每年约1000万人过早死亡，并使世界生产总值减少2-3.5%。而传统的微生物学分离方法（如烧瓶和琼脂板）非常耗时且不易保持突变库的遗传多样性，因此需要新的方法来发现并阐明抗生素的作用机制，特别是筛选不受先前存在的耐药机制影响的新靶点或新化合物。基于此，油包水微滴成为替代传统方法的高通量方法，特别是用于表型筛选。但在微滴中同样面临荧光染料标记的困扰，必须使用表达荧光蛋白的菌株才可实现高通量分选。

为了解决这一困扰，剑桥大学的研究人员发表了题为“High-throughput screening of antibiotic-resistant bacteria in picodroplets”的研究，展示了一种基于微流控平台，以非标记的方式高通量评估和分离抗生素耐药细菌的方法。该方法用于：a)大肠杆菌(HS151)群体中抗生素耐药频率测定；b)单个耐夫西地酸突变体的分离，用于DNA测序；c)发现新的AMR机制，这些机制可能成为抗菌药物发现的目标。

结果与讨论

1 控制多个或单个菌的包裹

本研究以大肠杆菌HS151为模型菌株进行AMR筛选。该菌株的多药耐药外排泵系统的外膜组分TolC缺失，使得其对包括夫西地酸（一种抑制细菌蛋白质合成的抗生素）在内的一类抗生素敏感。研究人员通过微流控技术将大肠杆菌在含有夫西地酸的培养基中包裹成微滴，微滴经孵育后只有AMR突变体会在抗生素作用下增殖。基于其光散射特性的差异，将含有增殖细菌的微滴与含有非增殖细菌的微滴区分开来（图1）。该流程包括将每个微滴中包裹大约100个细菌，通过筛选1×10⁷个微滴，可以覆盖10亿个细菌。而抗性突变体以10⁻⁷的频率自发出现，这意味着在每10亿个细菌中/在筛选的1×10⁷个微滴中，研究人员预期可以获得大约100个阳性突变菌。

这种方法的优点在于通过将多个细胞（例如100个）包裹在微滴中：1）需筛选文库的数量减少了100倍，大大减少了分析整个细胞群的时间和试剂，同时不会错过任何有价值的阳性结果；2）所有初始突变细胞都有平等的增殖机会，从而更好地保持整个突变库的多样性；3）该方法不需要荧光标记，因此可以作为AMR发现的通用平台。

图1. 基于微滴的耐药突变体筛选工作流程示意图。

2 微滴中的细菌增殖

先前的研究表明，微滴可以用作细菌增殖的生物反应器。在这项工作中，研究人员开发了一种定量测量微滴中大肠杆菌生长动力学的方法。如图2B所示，在3 ml培养液中接种的~3×10⁸ CFU·mL-1菌悬液在孵育后3 h内达到生长静止期，比1×10⁶ CFU·mL-1菌悬液（5 h）更快。总的来说，与标准3 ml接种的培养方式相比，发现在微滴中细菌的增殖得到了增强。这些结果在研究人员所有的实验中都是可重复的。这是由于微滴在碳氟油中被含氟表面活性剂稳定，而碳氟油的氧溶解度比水高得多，因此微生物生长的增强可能是由于微滴的高表面积与体积比以及它们暴露于富氧环境所致。

图2. 微滴中细菌的增殖。A. 分别显示由1×10⁶ CFU mL^-1和~ 3×10⁸ CFU mL^-1生成的两个微滴样品。B. 显示了HS151从每个微滴一个细胞（接种起始量1×10⁶ CFU mL^-1）开始到每个微滴约100个细胞（接种起始量3×10⁸ CFU mL^-1）的典型生长曲线。比例尺= 100微米。

3 夫西地酸对微滴细菌增殖的影响 

为了评估在微滴中是否可以测量抗生素对细菌生长的抑制作用，研究人员还测量了大肠杆菌HS151在不同浓度的夫西地酸存在下的细菌生长曲线。结果发现，在微滴和3 ml培养中，细菌增殖均受到显著抑制。在比较使用4 μg·mL-1和16 μg·mL-1的夫西地酸的结果时观察到剂量效应(图3A)。在微孔板进行互补最小抑菌浓度 (Minimum Inhibitory Concentration, MIC)实验也证实了这一点。先前通过传统琼脂培养基筛选获得的耐夫西地酸的大肠杆菌HS151突变体经微滴包裹在16 μg·mL-1的夫西地酸下观察其生长，发现微滴允许突变体在与亲本HS151相似的时间内增殖。这表明微滴具有稳定性和良好的环境，可用于抗生素的高通量细胞筛选研究，并表明微流控平台可用于分离自发耐药菌株。同时还观察到，突变体在增殖过程中，其形态与亲本菌株在微滴中的形态不同：在16 μg·mL-1夫西地酸的作用下，突变体在微滴中密集生长；相比之下，亲本菌株则采用丝状形态，细胞数量低得多（图3B）。

图3. 抗生素作用下微滴中细菌的生长情况。

4 利用微滴分选平台对自发性抗生素耐药突变体进行分选

研究人员使用由亲本HS151菌株与突变菌株混合构建的模型细胞库来测试系统的性能（图4A）。用3×10⁸ CFU·mL^-1易感细胞和3×10⁵ CFU·mL^-1突变体组成细胞悬液，在16 μg·mL^-1的夫西地酸中生成微滴（每个微滴平均应包含100个细胞）。经摇床培养箱37°C，220 rpm孵育过夜后，将模型库注入检测和分选生物芯片。检测分选生物芯片如图4B所示，由上游微滴注射模块和下游微滴分选模块组成。当微滴通过激光束时，散射光被光纤收集并由PMT检测。如果散射信号高于用户定义的分选阈值，系统将向电极发送单个方波脉冲(持续时间= 1.5 ms，振幅= ~ 800 V)，微滴通过介电分选进入分选通道。否则流入废液通道。结果表明，该方法可以很好地区分亲本和突变株（图4D，4E）。高振幅信号(更大的散射)来自含有增殖突变体的微滴。这是通过计算较高峰值与总峰值数量的比率来验证的。计算显示检测到11%的阳性命中，接近基于输入细胞数的理论计算。

图4. 基于光散射的细菌筛选。图A和B显示了用于细菌增殖检测和分选的光学装置和微流控生物芯片设计。图D显示了PMT检测到的微滴的光散射信号。图E显示了该数据的峰值振幅直方图。

为了验证对自发耐药突变体的筛选能力，将HS151在不含抗生素的3 mL培养基中培养过夜，然后用添加16 μg·mL^-1夫西地酸的新鲜培养基将其稀释至2.7×10⁸ CFU·mL^-1，并1714 Hz下产生1200万个约330 pL微滴（耗时≈2 h）。经孵育（16 h）、检测和分选（13 h）。在4.6 h的光散射信号记录和分选期间，共观察到12次可能的阳性微滴。图C显示了一个弱阳性微滴被分选到分选通道中的图像。假设阳性事件的时间分布相等，13 h分析期间的总体阳性命中估计为(12/4.6)×13 = 34，抗性频率(FOR)为(34/1×109) = 3.4×10⁻⁸。

结论

本研究证实了微滴中耐药细菌的高通量筛选，采用一种基于光散射的新型微滴分选方法，从混合细胞的微滴中筛选含有增殖细胞的微滴。通过对比实验统计数据和理论计算，验证了该方法的有效性，并成功检测和分选了大肠杆菌HS151自发耐夫西地酸的突变体。对突变体的DNA测序分析证实了fusA基因的单核苷酸多态性（fusA基因编码夫西地酸的蛋白靶点）。

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