利用HiFi Iso-seq鉴定人脑区域特异性基因表达异构体

Background

脑部疾病，如神经退行性疾病和精神疾病是多因素疾病，对人类发病率和死亡率有重大影响。以往基于大脑基因表达分析的研究大多是基于短读长测序技术或微阵列数据，它们的异构体只能从短读长测序的序列中推断出来。使用长读长测序的转录组技术使我们能够一次读取转录本从5 '到3 '非翻译区(UTR)和polyA尾的整个长度，无需RNA打断及后期生信拼接，使我们能够捕获更复杂和精确的转录本特征，发现许多未知异构体和组织、年龄特异性基因表达模式。本文对从人类死后大脑的三个区域——颞叶皮层、下丘脑和小脑(小脑皮层)提取的RNA进行了长读长测序，重点研究了区域特异性转录组的特征，以期阐明人类大脑中区域依赖性基因和异构体表达模式，并获得可用于未来疾病研究的控制数据。

研究方法

研究人员选择了四名没有脑部损伤或感染、在50多岁或更晚时候死亡的男性受试者，分别从小脑、下丘脑和颞叶皮层提取RNA，并使用PacBio的Sequel IIe系统进行了Iso- Seq，分析了基因的异构体、基因的区域表达差异、同一基因在不同区域的不同异构体数量及异构体的区域表达差异。除此之外，作者还关注表观遗传学信息，使用Illumina Epic阵列进行全基因组甲基化分析，对从相同样品的相同区域获得的长读RNA测序(Iso- Seq)和DNA甲基化数据进行联合分析以检验DNA甲基化对选择性剪接的影响。

研究思路

研究结果

1. 三个脑区全长转录组的概述

对于每个样本生成了225 - 401 Gb的原始测序数据和7 -14 Gb的HiFi数据，在所有样品中平均鉴定出27,643个异构体和66,860个非冗余异构体，图1A分别是在小脑、下丘脑和颞叶皮层中检测到的异构体数量以及括号中所示为未知异构体的百分比。这些异构体被注释到14,382个已知基因和52个未知基因(图1B)。当按脑区进行比较时，小脑的异构体数量明显低于下丘脑和颞叶皮层(图1C)。在这三个区域中普遍表达的未知异构体的比例为42.9%，而仅在其中一个或两个区域中表达的未知异构体的比例更高(61.2至82.2%)(图1A)。

将检测到的异构体与综合人类基因注释数据库GENCODE v.41中的异构体进行比较，并将其分为以下八类:完全剪接匹配(FSM)、不完全剪接匹配(ISM)、包含已知剪接元件的新转录本(NIC)、未知剪接元件的新转录本(NNC)、融合、基因内、反义和基因间，大约57.3%的异构体是FSM, 27.9%是NIC, 8.5%是NNC异构体。ISM在鉴定的异构体中所占的比例并不大(5.8%)(图1D)。

图1. 使用Iso-Seq在人类小脑、下丘脑和颞叶皮层中检测到的异构体。

2. 类别和脑区之间异构体特征的比较

作者接着研究了异构体的特征，并在类别和大脑区域之间进行了比较。首先，研究人员检查了八个类别中每个类别表达异构体的样本数量。与未知异构体相比，FSM异构体在许多样本中的比例更高(平均为6.51)，ISM(平均为6.12)，NIC(平均为4.05)，NNC(平均为3.29)(图2A)。在脑区的比较中，ISM在这三个区域表达的异构体最多，其次是FSM;与FSM相比，NIC和NNC在一个或两个区域表达的异构体的百分比明显更高(图2B)。接下来，检查每个基因的异构体数量，平均鉴定出2.74种异构体(图2C)。当按区域进行比较时，每个基因的异构体数量在小脑中明显低于其他区域(图2C)。异构体的长度在3 kb左右达到峰值，并且在下丘脑中稍短一些(图2D)。当按类别检查每个异构体的长度时，未知异构体在所有脑区都更长(图2D)。当检测每个脑区每个基因的外显子数量时，小脑的数量较高(平均每个基因11.1个)，下丘脑的数量明显较低(平均每个基因10.6个)(图2E)。按类别比较，FSM(平均每个基因9.32个)和未知异构体的每个基因外显子数分布有显著差异(图2E)，特别是NIC(平均每个基因13.5个)和NNC(平均每个基因12.8个)，这在区域之间是一致的。当检测蛋白质编码异构体的比例时，结果显示13.0%的FSM是非编码的，而其他未知异构体的非编码异构体为~0.5%，这表明大多数未知异构体被预测为蛋白质编码(图2F)。

图2. 按类别或脑区的检测转录本概述

3. 在不同的大脑区域具有不同的主要异构体的基因

对于每个样本，计算单个异构体的表达量与总基因表达量的比值(%)，并比较各区域间的比值及其排名，搜索比值差异超过20% (P < 0.05)的异构体。结果，在小脑与下丘脑中鉴定了145个基因的193个异构体，在小脑与颞叶皮层中鉴定了114个基因的147个异构体，在下丘脑与颞叶皮层中鉴定了47个基因的55个异构体(表1)。

表1. 基因表达比例因大脑区域不同而不同的十大异构体。

在所有三个比较中检测到异构体的基因中，GAS7是P值最低的基因。转录本ENST00000580865.5和ENST00000437099.6分别主要在小脑和颞叶皮层表达。在下丘脑中，ENST00000585266.5和未知异构体TALONT000412184都被表达(图3A)。将本研究中检测到的异构体编码的预测氨基酸序列与小鼠的预测序列进行比较，结果表明，小鼠大脑中表达的较长的异构体Gas7与下丘脑中检测到的ENST00000585266.5的同源性为97.33%，与颞叶皮层中检测到的ENST00000437099.6的同源性为97.35%。另一方面，小鼠小脑中表达的较短异构体Gas7- cb与小脑中检测到的ENST00000580865.5具有97.9%的同源性(图3B)。

在小脑和下丘脑的比较中P值最低的异构体是synaptoporin (SYNPR)，它是小脑和颞叶皮层分析中比值差异最高的两个异构体之一。ENST00000295894.9在下丘脑和颞叶皮层表达，而小脑则表达了5个新的、更长的异构体，其转录起始位点(TSS)在ENST00000295894.9上游150 kb以上(图3C)。研究表明，在每个大脑区域中具有异构体表达的差异，这些在特定大脑区域主要表达的不同异构体分别在生物过程中发挥关键作用。

图3. 基因实例，使用不同的异构体取决于大脑区域。

最后，作者还进行了转录组和甲基化数据的整合分析，使用从本研究中使用的相同样本中提取的DNA进行了基于阵列的全基因组甲基化分析。研究表明不同脑区不同异构体的基因附近有更多的差异甲基化位置（differentially methylated positions，DMPs）和差异甲基化区域（differentially methylated regions，DMRs）。甲基化位点在上游区域和基因增强子中特别丰富，当详细考虑异构体之间的结构差异时，很明显，DMPs在TSS下游的1kb区域特别丰富，在具有不同第一外显子的异构体之间。因而表观遗传学可能在不同脑区异构体使用的不同背景下发挥重要作用。

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