Covaris助力FFPE样本蛋白组学研究

如何充分地从组织细胞中释放蛋白，就成为了广大科学家关注的问题。为了解决这一问题，Covaris公司提出了完整解决方案。

在当今生命科学和医学领域中，蛋白质组学以其引人瞩目的成就和巨大的潜力成为一个备受关注的前沿研究领域。蛋白质组学不仅仅是研究蛋白质的组成、功能和结构，更是关注如何全面理解生物体内所有蛋白质的表达、修饰和相互作用，从而揭示生命的奥秘。这一领域的迅速发展为我们提供了窥探细胞、组织和器官功能的独特窗口，为疾病的诊断、治疗和个性化医学的实现提供了强大的工具。

蛋白质谱技术作为研究蛋白组学的有力工具，正在被全世界关注和应用。在蛋白质谱的应用过程中，质谱前样本制备是非常关键的一环，关系到最终的数据质量和结果。其中，蛋白的提取又是重中之重，蛋白能否从组织细胞中充分释放关系到最终质谱鉴定到的蛋白种类和数量，因此，如何充分地从组织细胞中释放蛋白，就成为了广大科学家关注的问题。为了解决这一问题，Covaris公司提出完整解决方案，基于其非接触式的聚焦超声方式、恒定低温的处理过程，可以充分释放样本中的生物大分子，提高得率，从而进一步提高下游质谱鉴定到的蛋白种类和数量，助力蛋白组学研究。

应用案例

文献案例一

慕尼黑工业大学研究人员Bernhard Kuster等人于2023年11月发表在The EMBO Journal上的文章“A region-resolved proteomic map of the human brain enabled by high-throughput proteomics”开发了一种可拓展的且高灵敏度的高效液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）方法用于人脑高通量蛋白质组学的研究，并通过分析不同的生物样本（人类细胞系、血浆、脑脊液和脑FFPE组织）来表征该方法的可行性和稳定性；另外，本研究提出了一个端到端的优化工作流程，基于Covaris R230聚焦超声仪进行蛋白样本制备，可进行大规模的人类FFPE脑蛋白质组分析，并通过分析人类大脑13个不同区域的11,000 多种蛋白质的定量蛋白质表达图以及>2,000个LC-MS/MS测量来证明其稳健性。由此产生的资源构成了迄今为止最全面的人类大脑蛋白质组图谱。

其中，针对FFPE和脑脊液的蛋白样本制备参考Muller等人2020年发表的文献中的SPS制备方法（图1），利用自适应聚焦超声（AFA）技术，通过超声波辅助从FFPE组织中提取蛋白质，结合autoSP3方法实现高通量、自动化且简化的样本制备流程。

图1. AFA技术与autoSP3整合的自动化组织蛋白质组学工作流程。

另外，本研究在此基础上还在脑组织工作流程中添加了使用二氯甲烷（DCM）的去脂脱脂步骤，起到类似组织清除的功能，以提高色谱稳定性，提高蛋白质鉴定率。具体样本制备流程如图2所示，FFPE样本解交联后转移到96 AFA-TUBE TPX板中，利用Covaris R230进行超声5分钟，之后进行除盐纯化、还原烷基化以及酶解等步骤，再用于LC-MS/MS分析。基于该蛋白组样本制备流程，可以从FFPE脑组织各区域中鉴定出10000多种蛋白，远远超过之前报道的大规模FFPE蛋白组学相关研究中鉴定到的蛋白信息，并且，所得数据质量接近新鲜冷冻组织样本，这对于分析人类生物库中数百万个存档的组织标本具有巨大的潜力。当然，也反映出基于Covaris AFA技术的质谱前样本处理流程对FFPE样本蛋白质组学研究是十分可行且高效的。

图2. FFPE脑组织样本制备流程。

文献案例二

FFPE组织样本是研究疾病潜在分子机制的宝贵资源，具有广泛的可用性以及低成本地长期保存组织结构和形态的能力；激光显微切割技术（LCM）已成为基于质谱的蛋白质组学分析中不可缺少的研究工具，用于临床和研究中从FFPE组织样本中获取特定区域。然而，由于LCM样本的处理面积较小，导致含有的蛋白量较少，使得蛋白的提取及其困难，因此需要一种稳健、高效的样本处理工作流程来处理大批量的LCM样本。基于此，本研究开发了一种基于Covaris AFA技术的FFPE样本蛋白质组学高通量工作流程，该工作流程可在96孔板中高效提取蛋白样品，并将胰蛋白酶消化步骤缩短至1小时，从而实现快速、高通量的样品处理。该研究是“A High-Throughput Workflow for FFPE Tissue Proteomics”于2023年6月发表在Journal of the American Society for Mass Spectrometry上。

本研究通过LCM从肾脏FFPE组织切片中收集了20 mm²的小管间质，并通过三个不同的工作流程（每个工作流程有16个样本重复）进行处理，如图3所示。结果显示，AFA辅助胰蛋白酶消化（AFA Accelerated)过程将消化时间从>12小时减少到1小时，并且，AFA步骤的引入使96孔板的工作流程自动化，加速胰蛋白酶消化，大幅减少消化时间，使工作流程的总工作时间<4小时。

图3.  FFPE组织蛋白质组学分析样品制备流程的比较。(A)3张FFPE肾组织的3张10 μm连续切片，脱蜡后通过LCM获取肾间质。使用三种不同的工作流程对样品进行处理：(1)使用标准工作流程进行提取和消化；(2)采用自适应聚焦声学(AFA)提取，然后进行过夜胰蛋白酶消化；(3) AFA提取和胰酶同时消化。清洗消化的肽段进行LC - MS/MS分析。(B)三种方法的时间流程图比较。

不仅如此，AFA Accelerated工作流程质谱鉴定到的蛋白和多肽的数量更多，变异系数（CV值）更低，如图4所示，标准工作流程中平均鉴定了1,273种蛋白质、4,614个多肽，AFA Overnight工作流程中鉴定了970种蛋白质、3,468个多肽，而AFA Accelerated工作流程中鉴定了1,485种蛋白质、5,495个多肽，优于其他两种方法。结果充分表明，AFA Accelerated工作流程提高了高通量蛋白质组学分析中的整体蛋白质和肽的鉴定，并且该流程具有更高的可重复性。

图4. AFA Accelerated工作流程产生显著更多数量和更高可重复性的蛋白质和肽鉴定。(A、B)三种不同工作流程处理的每组16个重复样品中鉴定的蛋白质及多肽的数量。

本研究开发了一种基于AFA技术的快速、高通量的蛋白组学工作流程，可以在不到4小时的时间内处理多达96个样品，并且可以整个样品处理工作流程实现自动化。不仅如此，该工作流程也同样可适用于样本有限的细胞系或组织。

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Covaris样本制备系统针对多种样本的蛋白质谱分析开发了一站式解决方案，无论是FFPE样本、激光显微切割样本、还是细胞或组织样本，都能帮助用户高效、稳定地获得生物大分子样本，进而协助用户提升下游实验的数据质量！Covaris公司一直致力于研发基于声学、机械及分子生物学的高性能组织样本处理系统，旨在帮助研究者实现快速、稳定、高效的样品预处理。

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