HiFi长读长单细胞测序揭秘精子发生的奥秘

来自浙江大学医学院邵逸夫医院的研究团队利用PacBio三代单分子测序技术HiFi测序对无精子症进行了研究。

人类精子发生是一个复杂且高度调控的过程，涉及有丝分裂、减数分裂和精子成熟的后续阶段。scRNA-seq技术的最新进展为配子发生、种系生态位通信和睾丸中的分子特征提供了新的见解，然而，传统的短读长测序技术无法检测到表达的转录本的重建，因为短的reads会破坏转录本序列的连续性，限制了在复杂位点上解决组装歧义。因此，长读长单分子DNA测序已被应用于基因组学，与短读长测序技术(长度小于300个碱基)相比，长读长测序可以准确地生成长度为几千个碱基的reads，可检测到以前遗漏的转录本异构体，可变剪接、基因融合等事件。

来自浙江大学医学院邵逸夫医院的研究团队利用PacBio三代单分子测序技术HiFi测序对OA（obstructive azoospermia，梗阻性无精子症）和NOA（non-obstructive azoospermia，非梗阻性无精子症）进行了研究，相关研究结果发表于“Long-read single-cell sequencing reveals the transcriptional landscape of spermatogenesis in obstructive azoospermia and Sertoli cell-only patients”预印本。

本研究通过结合scRNA-seq和长读单细胞测序(LRSC-seq)，揭示了OA和NOA患者精子发生的长读转录图谱，在各种睾丸细胞中鉴定了长读转录本、新基因和特异性表达长读转录本。

研究结果

01 测序数据集概述

研究人员从OA和NOA患者的睾丸活检中分离出单细胞，通过PacBio长读长单细胞测序技术与短读长scRNA-seq结合进行测序，对10种生殖细胞类型和8种体细胞类型进行分类（图1A），长读OA (No.4.5.6)和NOA (No.4.5.6)组不同细胞类型的百分比如图1B所示。NOA仅含有支持细胞(Sertoli cells，SCO)，SCO主要包括支持细胞、周细胞、肌样细胞、间质细胞、巨噬细胞、肥大细胞和内皮细胞（图1B）。

图1. 细胞类型与百分比

使用PacBio scRNA-seq检测单细胞水平的长读长转录组多样性，在OA的细长和圆形精子中，NIC（包含已知元件的新转录本）和NCC（未知剪接元件的新转录本）约占所有转录组类型的45%(图2A)，SSCs（Spermatogonial stem cells,精原干细胞）含有约25%的NIC和NCC。还鉴定了不同细胞类型中长读转录组的数量（图2B右）。OA和NOA共鉴定出130,426和49,508个转录本，其中新转录本分别为100,517和26,002个(图2C)。此外，在OA和NOA中分别检测到36,373和1,642个新基因(图2D)。这些新基因可能为精子发生和男性不育的机制提供新的见解。

图2. PacBio scRNA-seq揭示OA和NOA样本转录异构体多样性

另外，作者还对AS（Alternative splicing，选择性剪接）事件进行了分析，AS事件包括外显子跳跃(SKIP)、盒式外显子(MSKIP)、单内含子保留(IR)、多内含子保留(MIR)、可变外显子(AE)、可变转录起始(TSS)和可变转录终止(TTS)。OA组的TSS数量超过178,671个，其中一半是新转录本。相反，MIR_ON类型最少。每种类型的转录本在生殖细胞和体细胞中占相似的百分比(图3A)。与OA中的生殖细胞相比，TTS和TSS在NOA的体细胞中较少(图3B)。

图3. OA和NOA样本中AS事件统计

02 长读长转录本特异性表达

不同的长读长转录组在生殖细胞和体细胞中特异性表达，且长读转录组的特异性表达（the specific expression of the long-read transcriptome，SE-LRT）在NOA和OA之间存在显著差异(图4A)。此外，SE-LRT的数量在粗线期高于其他细胞培养阶段，其他细胞阶段SE-LRT数量均少于6个。内皮细胞在NOA中有13种SE-LRT, OA无。支持细胞在OA(JUN、HSPA1A、SPARC、CALM1、AARD)和NOA(MT−RNR2、PSMA7、RAB31、SERPINA5、GATM)的SE-LRT差异显著，提示NOA中睾丸微环境发生了显著改变(图4B)。

图4. PacBio scRNA-seq揭示序列多样性

在本研究中，具有特异表达的长读长转录组详细结构如图5所示。只有CCNI在SSCs中有特殊表达，CCNI属于细胞周期蛋白家族，它与有丝分裂的诱导和控制有关；HSP90B1至少有8种异构体，而在偶线期中只出现了第一种类型。精原细胞中发现HMGB1和PTMA两个SE-LTR，双线期检测到YWHAQ、PA2G4和PABPC3 三个SE-LTR等。SE-LRT可能在相应的生殖细胞中发挥独特的作用。

图5. 不同细胞类型样品中基因转录本异构体的多样性

作者还对支持细胞表达的长读长转录组进行了研究。支持细胞通过支持胎儿生殖细胞向雄性通路的投入、维持精原干细胞生态位、协助生殖细胞减数分裂和将成熟精子释放到精小管管腔参与精子发生。本研究在OA的支持细胞中发现了JUN、SPARC、HSPA1A、AARD、CALM1等5种SE-LTR(图6A)。SPARC是一种钙结合蛋白，由成年小鼠睾丸的支持细胞和间质细胞分泌，用于睾丸分化。AARD在睾丸中高度表达，仅报道过一种异构体。CALM1有六个异构体，其中一个在支持细胞中表达。在NOA的支持细胞中发现了SERPINA5、GATM、RAB31、PSMA7和MT-RNR2 5种SE-LRTs(图6B)。与OA相比，NOA中的支持细胞转录组异常，这可能导致睾丸微环境衰竭。

图6. 支持细胞特异性表达转录本的基因组结构

支持细胞骨架主要由肌动蛋白和微管组成，它们支持精子发生。这些细胞骨架是毒物诱导男性生殖功能障碍的目标。先前的一项研究报道，肌动蛋白和微管细胞骨架在SCO中存在缺陷。在本研究中，NOA中肌动蛋白的结构发生了变化(出现了额外的外显子)。H3.3对精子发生至关重要，它由两个不同的基因H3f3a和H3f3b编码。先前的一项研究表明，H3f3B有六个异构体。在本研究中，NOA没有长外显子，这表明H3f3B可能在支持细胞中发挥重要作用，从而支持精子发生(图7A)。基因间转录本和反义转录本被定义为新基因。在这里，研究人员选择了四个新的OA和NOA基因，在OA中，新基因43252与SLC25A31位置重叠，新基因61435与MAGEC2位置重叠(图7B)。在NOA中，新基因 CLNS1A_AS仅包含两个外显子，而新基因 SERPINI1_AS由三个外显子组成(图7C)。

图7. 新转录本和基因的基因组结构

Summary

错误剪接可以改变或取消关键的生理蛋白质功能，导致各种人类疾病，包括神经退行性疾病、免疫和传染病、代谢疾病、心血管疾病和癌症。在本研究中，通过结合scRNA-seq和LRSC-seq，在单细胞水平上分析了长读转录本，这些发现可能为人类精子发生和男性不育的发病机制提供新的见解。

与短读长测序技术不同，单细胞、长读长测序技术可以直接检测全长异构体多样性和新的转录本。虽然短读长转录组测序已经广泛应用了几十年，但它只能捕获转录本的小片段，缺乏明确的异构体数据，导致许多错误的异构体推断。使用长读长测序技术可以端到端捕获转录本，使异构体推断明确。

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