复杂单链核酸纳米结构的体外及体内自折叠

　　

核酸纳米结构（DNA/RNA nanostructure）作为一种可灵活设计、可精确编码、可准确组装的人工纳米结构，已在诸如环境监测、生物计算、智能材料等众多领域显现出可观的应用前景。凭借着碱基之间严格精确的互补配对（A-T/U、C-G），核酸分子可通过其序列片段之间的匹配识别实现分子内或分子间的结合，进而得以实现复杂的高阶组装，从而形成具有特定形貌、特定功能的纳米结构。

迄今为止，绝大多数的核酸纳米结构的设计和组装均是通过两种主流的组装策略来实现的——折纸结构（origami）组装策略和瓦片/砖块（tiles/bricks）组装策略，这两种策略皆是依赖于对众多条单链核酸分子之间组装行为进行复杂的操控。由于这两种策略的实现都需要众多的核酸分子的参与，且相比DNA而言，RNA的合成难度更大、步骤更繁琐、成本更高，这就造成了在整个领域中DNA纳米结构的研究占绝对主流、RNA纳米结构较少报道的现状。此前有研究报道了一种全新的核酸纳米结构组装策略，旨在将单一一条核酸链进行内部的有序折叠（single-stranded Origami, ssOrigami），可以实现紧密堆积型核酸纳米结构的组装。基于此种策略，本文作者进一步开发了一种全新的单链网格状核酸纳米结构的设计策略，该策略可以将单链DNA或者RNA作为构筑单元，使其进行多级折叠进而组装形成复杂的网格状结构。

本研究从分子多级折叠出发，利用两种核酸结构模块的稳定性差异划分了组装步骤的先后顺序。这两种结构模块中，双螺旋模块的稳定性较高，Branched kissing loop (BKL)模块稳定性较低，自由能的差异造成了两种模块形成的先后顺序，稳定性较高的双螺旋模块先形成，之后稳定性较低的BKL模块再形成。基于此发现，本研究中的ssOrigami组装策略中，第一步折叠是由双螺旋模块的形成引发的，产物为一个包含了众多茎环结构（stem-loop）的前体结构；在第二步折叠过程中，这些茎环结构按照预期的设计相互之间进行成对的识别并结合形成稳定性稍弱的BKL模块，使上一步折叠的前体结构进一步组装成完全体结构。并且由于BKL模块本身分枝状的结构特性，将其安置在C形状的结构单元拐角处时，BKL模块的形成可以引导这些C形单元有序组装成规则的网格状结构。通过这种组装策略，本文作者成功设计了多种多样的单链DNA和RNA纳米结构，这些纳米结构的正确组装也进一步验证了此策略的可行性和可靠性。

图 1. 利用分级折叠策略指导单链DNA/RNA进行折叠组装。 (A) 分级折叠过程示意图。(B) C型结构模块排布成预期网格状结构示意图。(C-E) BKL结构模块示意图。

基于此组装策略，作者接下来又初步探索了这种单链网格状折纸结构的功能化应用。他们将一种具有代表性的功能化元件——RNA荧光适配体嵌入在RNA网格状结构的特定位置，并用一段12bp的螺旋区域将适配体与网格结构进行区域化分隔，以保证功能化元件与网格状结构的独立折叠，降低了错误折叠情况的发生概率。原子力显微镜和荧光显微镜表征结果都显示了预期结构的正确组装和荧光活性，此外细胞荧光实验也表明该折叠策略在细胞内的可适用性。本研究建立了新的结构设计组装策略，拓展了核酸纳米结构的设计空间，对今后DNA和RNA纳米结构领域的发展具有重要的意义。同时，功能RNA被引入到理性设计的二维和三维结构之中，为RNA治疗、RNA生物学赋予了新的可能性，并大大丰富了应用前景。

图 2. 功能化单链RNA网格状纳米结构的构建。 (A)两种具有荧光活性的RNA网格状纳米结构示意图。(B) 单分散性和可聚集性纳米结构的设计。(C-F) 功能化单链RNA网格纳米结构的原子力显微镜和荧光显微镜表征结果。

该研究成果由清华大学生命学院魏迪明分子设计课题组（MADlab）和清华大学免疫所、基础医学院曾文文课题组合作完成，论文题为“单链网格状核酸纳米结构的的程序化折叠”（Programmable in vitro and in vivo folding of single-stranded nucleic acid wireframe origami），于2024年5月22日发表于《化学》（Chem）期刊。清华大学生命科学学院2017级博士毕业生张天晴和基础医学院2017级博士生钱鑫民为本文的共同第一作者。其中张天晴博士、曾文文教授和魏迪明副教授为本文的共同通讯作者。值得一提的，本文是张天晴博士自主设计和构架的RNA新范式一系列开发中的开篇之作。该研究得到科技部、国家自然科学基金委、清华-北大生命科学联合中心等基金资助。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.chempr.2024.04.023