揭开HiFi测序的“谜，误”！

在基因组学快速发展的领域中，快速进步的技术令人目不暇接，同时对技术落后的恐惧是真实存在的。如果您想紧跟技术发展的潮流，您就需要了解最真实的信息。不久前，长读长测序还是一项新兴技术。今天，PacBio HiFi长读长测序技术已在全球范围内被广泛用于测序成千上万的基因组、表观基因组和转录组。HiFi测序适用于规格不同的项目，从学术研究到大规模人口健康研究。技术变革的速度之快，以至于人们对长读长测序的准确性、用途、成本和便利性的认知常常与今天的真实情况不符。请您跟随我们的脚步，我们将纠正关于长读长测序的常见误区。

准备好观念颠覆、灵感激发，忘记那些充满“一直以来都是这样做”态度的陈旧教科书吧！

一、真实的准确度

误区 1:

PacBio长读长测序的错误率太高。

事实：

这一说法过时了。

许多科学家首次了解到长读长测序是在2011年PacBio RS推出时。该系统以其能够产生1-10 kb的读长脱颖而出，但有一个主要缺点：大约有10%的原始数据错误率。时至今日，准确性对于long-read nanopore仍然是一个挑战，但PacBio已实现了巨大的飞跃。2019年，PacBio推出了HiFi测序技术，对于15-20kb的读长，其准确度达到了99.9%（0.1%的错误率）。

今天，这种准确性是一个显著的优势。HiFi技术的长读长与短读长测序具有相同的准确性，同时具有跨越基因组重复所需长度的额外优势。HiFi技术已被用来生成每百万个碱基中少于一个错误的人类基因组数据，并用于识别单个DNA分子中的突变。包括precisionFDA Truth Challenge v2和ABRF Next-Gen Sequencing study 在内的一系列技术基准测试表明，HiFi测序在多个维度上都是准确的技术。

二、价格的争议

误区 2:

与其他测序技术相比，HiFi测序太贵了。

事实：

这一说法过于简单。

最初的长读长测序仪因其昂贵的价格和运行成本令人望而却步。在21世纪的最初20年，测序一个人类基因组的成本高达数千美元，即使是小型微生物基因组也因文库制备成本而被认为是非常昂贵的。但持续的技术创新已经改变了这一点。2022年推出的Revio系统将30× 的HiFi人类基因组的测序成本大幅降低。文库制备工作流程的改进，以及新的高通量HiFi制备试剂盒的引入，已将制备样本的成本降低许多。同时多重混合样本可以进一步降低测序成本。

HiFi测序每Gb的成本可能比大规模短读长测序平台昂贵，但它与流行的中通量平台的成本相当。更重要的是，与其他测序技术相比，HiFi测序提供的信息更丰富，每个结果的成本更低。虽然一些短读长测序方法可能提供可承受的base-for-base成本，但它们的范围有限，并且通常需要额外的后续测试来实现结构变异检测、基因组定相分析并解决覆盖均匀性问题。这些附加方法中的每一种都会产生自己的时间和劳动力成本，并且这些成本会增加。

相比之下，HiFi测序允许研究人员通过单一检测捕获遗传变异的全貌，并以比其他测序技术低得多的总成本达到结果。

三、通量的真相

误区 3:

HiFi测序通量低，且无法有效扩展。

事实：

这一说法是错误的。

通量是长读长测序已经发生戏剧性变化的另一个领域。每一代PacBio系统的规模都实现了数量级的增长。与Sequel IIe系统相比，Revio系统带来了15倍的通量提升。它提供更完整、可定相的人类基因组数据，其规模甚至是大型商业实验室和服务商使用都毫无问题；每天输出360Gb数据，每年最多可输出 1,300 个人类基因组。使用 Revio 系统，实验室可以扩大项目规模，每年对多达约 3,900 个植物/动物基因组 (1 Gb) 进行从头组装、约 5,200 个 Kinnex 全长 RNA 样本或约 1,300 个 Kinnex 单细胞转录组样本进行测序。

四、流程简化

误区 4:

HiFi测序样品制备和分析工作繁重、耗时，并且与现有的实验室基础设施不兼容。

事实：

这一说法过时了。

样品剪切、HiFi文库制备和数据分析方案比以往任何时候都更快、更简单。使用SMRTbell试剂盒3.0准备8个样本只需大约6小时（加上QC），或者剪切和准备96个HiFi基因组测序样本只需大约13小时，同时所有这些流程都可以实现自动化。

测序完成后，PacBio数据分析方案可用于工作流程的每一步，如从variant calling到定相的从头组装。像PacBio WGS Variant Pipeline 这样的工具可用于次级和三级分析，从比对到注释。此外， PacBio Compatible 合作伙伴以及其他社区支持的分析工具使 HiFi 测序新手可以轻松上手。

五、应用不受限

误区 5:

长读长测序技术是一项针对小众群体的技术，只适用于新基因组组装和检测复杂的结构变异。

事实：

这一说法是错误的。

作为2022年的年度方法（ Method of the Year in 2022），长读长测序不再是一项特定范围应用的技术。相反，它正在迅速成为研究人员选择的方法，以便获得更完整的生物学视图，并用一次检测几乎可以挖掘到所有类型的变异。在Revio系统上HiFi测序为每次运行带来了多功能性和多组学的应用。该系统允许您同时运行四个SMRT Cell，这意味着科学家可以使用一张芯片进行WGS，一张芯片进行RNA，一张芯片进行单细胞RNA，一张芯片进行扩增子——全部同时进行，每次测序运行中都进行甲基化检测。这不仅一次开启了更多的“组学”之门，而且还使实验室能够同时运行的样本类型多样化（人类、植物、动物、微生物等）。

仅2023年就有1,000多篇同行评审出版物证明，HiFi测序的强大功能在持续得到认可。超过40个国家/地区安装了 1,200 多台 PacBio 测序仪，长读长测序显然不是一项小众技术，而是未来的方法。

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本期内容，为您解答了关于HiFi测序的“误区”！作为引领发现前沿的科学家，保持领先于测序技术的工作方式意味着您处于领先地位。借助HiFi技术，获得突破性新发现的可能性几乎是无限的。如果您感兴趣，请联系我们的工作人员吧！

基因有限公司作为PacBio公司的中国区合作伙伴，自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内，一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训，技术支持，应用培训与售后维护工作，赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。

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