微生物组学高速发展助力法医鉴定技术新突破

微生物组研究可以获得微生物群落的组成特征和多样性，解析微生物与宿主、环境之间的相互作用关系。微生物法医学最初主要关注生物恐怖主义相关的病原微生物，近年来随着高通量测序技术的发展，微生物组也大量应用到个体识别、地理位置和死后间隔推断等方向，进一步从土壤、水体等与案发现场相关的可疑物证中解锁出更多证据信息。

说到微生物组学，不得不提到人体微生物组计划（Human Microbiome Project, HMP）。HMP项目通过描绘人体不同器官中微生物基因组图谱，探索人体与微生物的互作关系。荷兰鹿特丹伊拉斯姆斯大学医学中心的研究人员开发了一种与分类学无关的深度学习（DL）微生物组方法，并基于HMP的2400多个样本16S rRNA基因测序数据构成了50个DL网络，用于精确鉴定检材的组织来源，所有类别的AUC值均超过0.97。在年龄超过21岁的80多个模拟案例样本中进行的其他取证验证测试也显示出相似的分类结果[1]。随后该团队又通过16S测序研究了唾液样本中微生物的数量和组成在离体后的变化规律，用于推断唾液样本沉积在案发现场的时间[2]。

除了HMP，MetaSUB (Metagenomics & Metadesign of Subways & Urban Biomes) 国际联盟发起的城市微生物计划也是一项备受瞩目的全球性微生物组项目。该研究已对来自全球60个城市的4728份样本进行了宏基因组测序，并对耐药微生物的分布与迁移进行了分析，研究人员发现城市特定的微生物分类特征可以用来预测样本的地理位置，准确率为78.9%[3]。在法医上利用微生物组进行地理溯源的主要限制在于无法在缺少比对样本的情况下推断物证的地理来源，MetaSUB目前包含了北京、上海、广州等城市的环境微生物组数据，相信随着更广泛的微生物组数据库的建立和机器学习算法的支撑，这一应用领域会迎来新的突破。

在微生物组研究中，建立一套从样本采集到数据分析的完整标准化方案是项目的关键，尤其是核酸纯化和文库构建过程，不同微生物核酸提取效率差异以及文库构建偏倚都会导致微生物丰度数据与真实情况大相径庭，那HMP和MetaSUB这类全球性项目经过大量的评估和对比后又使用了哪些方案呢？

微生物裂解与核酸纯化

DNeasy PowerSoil Pro Kit

利用拭子收集的环境样本中微生物含量极低，提取微生物核酸的挑战不仅在于保证核酸产量，还在于如何同时确保微生物多样性信息的真实性。QIAGEN第二代DNeasy PowerSoil Pro Kit包含的升级款PowerBead Pro珠磨研磨管中优化的研磨珠粒径可有效提高微生物和研磨珠碰撞几率，DNA产量更高。研磨珠材质坚硬，可高效均匀裂解任何类型的细菌、真菌和古菌，获得更准确的微生物丰度信息。第二代抑制因子去除技术（IRT）仅需室温一步混合后即可有效去除环境样本中的抑制剂，保障更准确的PCR、qPCR和NGS数据。

PowerSoil Pro Kit帮助获得更高的细菌OTUs

宏基因组文库构建

QIAseq FX DNA Library Kit

QIAseq FX仅需简单的三步反应操作，在3小时内获得宏基因组文库。QIAseq FX技术适应于广泛的样本起始量范围，20 pg-1 μg的DNA都轻松应对。QIAseq FX方案不受基因序列影响，将G/C偏好性降低到最低，适用于广泛来源的DNA，如来自包括人（含FFPE样本）、植物、病毒、甚至具有极端G/C含量细菌的起始DNA。QIAseq FX方案可选PCR-free建库方式，更是避免了因扩增导致的错误，并且将文库偏好性降到最低，获得最真实的宏基因组数据。

16S rRNA研究方案

QIAseq 16S/ITS Region&Screening Panel

QIAseq 16S/ITS Region&Screening Panel可针对16S/ITS全长或任意区域进行测序分析，最低仅需1 pg上样量，且微生物群组比例分析结果也不会产生明显偏差。Phased Primers扩增子引物设计可以有效提高测序质量和碱基平衡度，来自高级别洁净生产线的UCP (Ultra CleanProduction) MasterMix PCR反应体系确保无任何背景微生物污染，检测结果更可靠。

一键式生物信息分析方案

CLC Genomics Workbench (Gx)

对于宏基因组或16S数据的分析，当研究人员没有专业生物信息学背景和编程经验时，基于Windows的桌面化分析软件CLC Genomics Workbench (Gx) 便是首选。该软件提供了微生物组学的完整分析流程，包括快速去除人源或其它物种来源的宿主DNA污染、计算样本中微生物种群分布以及Alpha和Beta多样性、宏基因组拼接以及探索微生物对应的生物学功能。

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参考文献

1. Lopez, Celia Diez., et al. Novel taxonomy-independent deep learning microbiome approach allows for accurate classification of different forensically relevant human epithelial materials[J].Forensic science international. Genetics, 2019, 41.

2. Celia.Díez López, Kayser M , Vidaki A .Estimating the Time Since Deposition of Saliva Stains With a Targeted Bacterial DNA Approach: A Proof-of-Principle Study[J].Frontiers in microbiology, 2021, 12: 647933. DOI:10.3389/fmicb.2021.647933.

3. Danko, D. , et al. "A global metagenomic map of urban microbiomes and antimicrobial resistance." Cell 184.11(2021):1-18.