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为解决 PD-L1+小细胞外囊泡（sEVs）分泌机制不明的问题，研究人员开展了 PKCα 对其调控作用的研究。结果发现 PKCα 以 p53 依赖的方式调节 PD-L1 表达和 sEVs 分泌，为免疫治疗提供新策略，意义重大。
在肿瘤的世界里，癌细胞就像一群狡猾的 “敌人”，它们不断进化出各种手段来逃避免疫系统的攻击，其中一种重要的 “武器” 就是细胞外囊泡（EVs）。EVs 是细胞释放的脂质双层包裹的小囊泡，就像细胞间通信的 “小邮差”，在肿瘤微环境中发挥着重要作用。而携带程序性死亡配体 1（PD-L1）的小细胞外囊泡（sEVs），更是癌细胞免疫逃逸的关键帮凶。
目前，虽然已经知道 PD-L1+ sEVs 与肿瘤的发生发展密切相关，但对于 PD-L1 是如何被装载到 sEVs 中并分泌到细胞外的具体机制，科学家们还知之甚少。而且，细胞内复杂的信号通路众多，到底哪些信号在调控 PD-L1+ sEVs 的分泌，这成了亟待解决的问题。为了深入了解这些关键机制，澳门科技大学的研究人员展开了一项深入的研究，相关成果发表在《Cell Death and Disease》杂志上。
研究人员为了开展这项研究，运用了多种关键技术方法。在细胞相关技术方面，进行了细胞培养，使用了 H1299、H1975 等细胞系；还通过细胞转染技术，将各种质粒导入细胞，以便观察和研究相关蛋白的表达和功能。在检测分析技术上，运用蛋白质免疫印迹分析（Western blot）来检测蛋白质的表达水平，利用纳米颗粒跟踪分析（NTA）来测定 sEVs 的大小分布和颗粒浓度 。
研究结果具体如下：
- PD-L1 与 sEVs 标记物高度相关：研究人员将 PD-L1 与细胞内囊泡标记物共转染到 H1299 细胞中，通过共定位分析发现，PD-L1 与 sEVs 标记物（如 CD63 和 CD81）共定位最显著，与内体（Rab5、Rab7）和溶酶体（LAMP1）标记物也有部分共定位，与自噬体标记物 LC3 共定位较少。构建 PD-L1-pHluorin 后发现，其荧光分布模式与 sEVs 标记物相似，且在 H1299-PD-L1pHluorin细胞中观察到 MVBs 与质膜（PM）融合的荧光信号，证实 PD-L1 存在于 sEVs 中。
- PD-L1 与 CD63 在 MVB-PM 融合上具有相似性：对 PD-L1 sEVs 和其他囊泡的融合信号持续时间进行统计分析，发现 PD-L1 sEVs 的融合信号持续时间比突触小泡和致密核心小泡长，与 CD63、CD81 sEVs 的信号持续时间有差异但峰荧光强度无显著差异，表明 PD-L1 MVB-PM 融合动力学与 CD63 相似。
- 钙在 sEV-PD-L1 分泌中起关键作用：细胞内钙在胞吐和胞吞过程中起重要作用，研究人员利用 ATP 刺激升高细胞内钙水平，观察到 PD-L1 融合事件显著增加；使用 BAPTA-AM 和 EGTA 螯合钙离子后，融合活性显著降低，说明升高的钙水平对 ATP 诱导的 PD-L1 sEVs 释放至关重要。
- PKCα 调节 PD-L1 sEVs 的释放：PKC 是钙信号下游的重要激酶，研究人员使用 PanPKC 抑制剂 G?6983 处理细胞，发现 ATP 诱导的 PD-L1 sEVs 融合活性降低。敲低 PKCα 后，在 H1299 细胞中，静息状态下 PD-L1 融合率显著上升，sEVs 中 PD-L1 和其他 sEVs 标记物的蛋白量增加；在 H1975 细胞中，ATP 诱导的融合事件减少，静息状态下融合活性降低，表明 PKCα 对 PD-L1 sEVs 的调节涉及复杂的信号级联。
- PKCα 以 p53 依赖的方式调节 PD-L1 表达：在 H1299 细胞中敲低 PKCα，sEVs 中 PD-L1 表达增加，同时全细胞裂解物中 ORAI1 表达上调；在 H1975 细胞中敲低 PKCα 则出现相反结果。进一步研究发现，H1299 细胞 p53 基因缺失，H1975 细胞携带 p53 R273H 突变，构建稳定表达 p53 R273H 的 H1299 细胞系后，敲低 PKCα，PD-L1 蛋白表达降低，说明 PKCα 对 PD-L1 表达的调节依赖 p53。
- PKCα 调节 STAT1 磷酸化和核分布：研究发现 PKCα 敲低会导致 H1299 细胞中 STAT1 磷酸化和核转位加速，p-STAT1 和 STAT1 表达上调；在 H1975 细胞和 H1299-p53 R273H 细胞中则相反，表明在无 p53 时，PKCα 缺失促进 STAT1 磷酸化和核转位，可能导致 PD-L1 表达升高；有 p53 时则相反。
- PKCα 作用于 p53 上游调节 STAT1 磷酸化：使用 nutlin-3 处理细胞上调 p53 表达，发现 H1975 细胞和 H1299-p53 R273H 细胞中核 p-STAT1 水平降低，且 p53 上调不影响 PKCα 表达，但敲低 PKCα 会使 p53 表达增加，说明 PKCα 位于 p53 上游，调节 p53 表达和 STAT1 磷酸化。
研究结论和讨论部分表明，该研究首次详细阐述了 PKCα 以 p53 依赖的方式调控 PD-L1+ sEVs 分泌的机制。这不仅为理解肿瘤免疫逃逸机制提供了新的视角，还为肺癌免疫治疗提供了潜在的新靶点。未来的研究可以进一步探索针对 PKCα 的靶向治疗策略，有望为肺癌患者带来更有效的治疗方案，在肿瘤治疗领域具有重要的理论和临床意义。
