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为深入探究小鼠神经元形态及分化机制，研究人员以 Thy1 YFP-16 小鼠品系为研究对象，分析神经干细胞（NSCs）分化模式。结果显示，Thy1-YFP 在体内外细胞追踪中效果显著，为神经发育及神经退行性疾病研究提供重要工具。
在神经科学领域，神经元的发育过程就像一场神秘而复杂的 “舞蹈”。从胚胎发育时期开始，神经元前体逐渐分化、成熟，这个过程涉及到细胞的成熟、分支形成等一系列精细的变化。在体外培养环境下，虽然与体内的三维环境有所不同，但二维的神经元分化也为科研人员提供了独特的研究视角，比如可以对单个细胞进行追踪、分析突触活动以及细胞分支情况等。然而，即使在相对简单的体外培养体系中，神经元投射的厚度和数量使得对神经元分支的分析变得异常复杂。尽管小鼠神经元形态在一定程度上已有研究，但关于神经元分支的详细研究仍然十分有限。同时，一个关键的问题是神经元在体外分化过程中是否保持功能活性，这也亟待解决。
为了揭开这些谜团，克罗地亚的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们选用 Thy1 YFP-16 小鼠品系，这种小鼠在运动轴突、视网膜、背根神经节、颈神经节、皮层（2 - 6 层）和小脑中，Thy1 基因控制下会表达神经元特异性黄色荧光蛋白（YFP）。研究人员希望通过分析神经干细胞（NSCs）的分化模式，包括分化标记、共定位模式、突触标记以及体外分化过程中细胞投射的追踪等方面，来深入了解神经元的发育机制。
最终，研究人员取得了一系列重要成果，这些成果发表在《Cell Death Discovery》上。在研究过程中，研究人员运用了多种技术方法。首先是细胞培养技术，从 E14.5 胚胎和新生幼崽的端脑壁分离神经干细胞（NSCs），并进行体外培养和分化。其次，利用免疫细胞化学（ICC）、定量 PCR（qPCR）和蛋白质免疫印迹（WB）技术，检测各种细胞标记物的表达水平。此外，还借助 IMARIS 软件进行图像分析，对神经元的形态参数进行量化。
下面详细介绍研究结果：
- NSCs 体外分化反映体内发育过程：研究人员分析了胚胎发育和出生后不同阶段 Nestin、MAP2 和 Thy1-YFP 的表达情况。发现 E14.5 时，Nestin 阳性细胞与 Thy1-YFP 阳性祖细胞比例较为适宜，P0 时 MAP2 与 Thy1-YFP 在皮层和海马体中的比例也有规律。通过对 NSCs 分化过程中标记物的检测，发现 Nestin 和 SOX2 表达随时间显著下降，而 PAX6 阳性细胞比例也逐渐降低，这表明 NSCs 体外分化与体内发育过程相似。
- DCX 与 Nestin 共表达：DCX 作为未成熟神经元的标记物，在体外分化早期与 Nestin 共表达，在 DIV3 达到峰值，之后 DCX/Nestin 比值下降。同时，TBR2 阳性细胞比例随神经元分化进程而降低，说明神经元逐渐从未成熟状态向成熟状态转变。
- 神经元在 DIV7 后达到分化平台期：研究人员检测了多种神经元标记物，如 MAP2、TUBB3、CTIP2、SATB2 和 SMI-312 等。结果显示，MAP2 在 DIV5 - DIV10 表达显著增加，TUBB3 表达也逐渐上升，CTIP2 和 SATB2 阳性细胞比例在不同阶段呈现特定变化，SMI-312 在成熟神经元中表达稳定。此外，YFP 表达在 DIV7 后也趋于稳定，且 PRIM 神经元与 NSCs 分化得到的成熟神经元中相关标记物表达水平相当，表明神经元在 DIV7 后达到成熟。
- 成熟神经元培养中存在 GFAP 阳性星形胶质细胞：研究人员对星形胶质细胞特异性标记物 GFAP 进行检测，发现其在神经球（DIV0）中不表达，随着时间推移表达显著增加。在 DIV7 和 DIV10 的 NSCs 分化细胞培养物以及 PRIM 细胞中均检测到 GFAP 阳性星形胶质细胞，这表明在神经元分化过程中，会有少量星形胶质细胞存在。
- Thy1-YFP 与神经元标记物共定位：通过计算 Pearson 共定位系数，发现 YFP 与 DCX 在分化早期共定位系数高，成熟神经元中下降；YFP 与 MAP2 共定位系数较高且稳定；YFP 与 SMI-312 共定位系数较低。与 DAPI、GFAP 的共定位系数处于背景水平，进一步证实了 YFP 的神经元特异性以及神经元在体外分化的成熟过程。
- YFP 不影响成熟神经元突触表达：研究人员在 DIV7 对成熟神经元的突触标记物进行检测，发现 YFP 阳性 / MAP2 阳性和 YFP 阴性 / MAP2 阳性神经元的突触标记物表达相当，仅 GEPHYRIN 有微小差异。这表明 YFP 的存在不影响成熟神经元的突触表达。
- YFP 用于神经元追踪效果显著：利用 IMARIS 软件分析神经元分支，发现 YFP 阳性神经元的 Filament Area、Filament Length、Filament No. Terminal Points 和 Filament No. Sholl Intersections 等参数在分化过程中显著增加，且与 YFP 阴性 / MAP2 阳性神经元相比，差异更显著。这表明 YFP 是研究神经元形态和细胞追踪的有效工具。
研究结论和讨论部分指出，本研究利用 Thy1-YFP 小鼠品系，通过多种实验方法，对神经元分化过程进行了详细的形态学分析。研究结果表明，YFP 在体内外细胞追踪中表现出色，是研究神经元发育和神经退行性疾病的宝贵工具。这一研究成果为神经科学领域的进一步探索奠定了坚实基础，有助于深入理解神经元发育机制以及相关疾病的病理过程，为未来的神经疾病治疗和干预提供了新的思路和方向。
