点亮未被充分研究的激酶：开发蛋白激酶 N（PKN）生物传感器的通用方法及意义

在生命科学研究中，蛋白激酶（Protein kinases）对细胞过程调节至关重要，但其活性监测面临挑战。研究人员开发用于蛋白激酶 N（PKN）活性监测的生物传感器。结果显示该传感器特异性良好，能检测内源性 PKN 活性。这为研究 PKN 信号通路提供工具，也为开发其他激酶生物传感器提供策略。

　　在细胞的微观世界里，蛋白激酶就像一群忙碌的 “信号指挥官”，它们掌控着细胞的各种生命活动，从细胞的生长、分裂，到对外部刺激的反应，无一不有它们的身影。然而，想要实时观察这些 “指挥官” 的工作情况，却困难重重。目前，虽然基因编码的荧光生物传感器（Genetically Encoded Fluorescent Biosensors，GEFB）为研究激酶活性带来了新的希望，但在开发针对众多激酶的生物传感器时，合适的底物肽难以寻觅，这就像为一把精密的锁寻找适配的钥匙，却发现大多数钥匙都不合适，严重阻碍了对激酶活性的深入研究，使得人类激酶组（human kinome）中大部分激酶的活性监测成为空白。

为了攻克这一难题，美国加利福尼亚大学圣地亚哥分校（UCSD）的研究人员 Julius Bogomolovas 和 Ju Chen 开展了一项极具意义的研究。他们致力于开发一种通用的生物传感器开发方法，并将其应用于蛋白激酶 N（Protein Kinase N，PKN），旨在为研究 PKN 信号通路提供有力工具，同时为其他未被充分研究的激酶生物传感器开发开辟新道路。

研究人员在此次研究中，主要运用了以下关键技术方法：首先，采用改良的 KESTREL 方法筛选 PKN 的底物肽，通过对细胞裂解液进行处理，结合放射性标记和质谱分析确定潜在底物；其次，利用免疫沉淀 - 体外磷酸化实验（immunoprecipitation-in vitro phosphorylation assay）验证生物传感器反映 PKN₂活性的能力；最后，借助活细胞成像（Live-cell imaging）和免疫荧光（immunofluorescence）技术，观察生物传感器在细胞内的表现以及 PKN₂的定位和活性变化。

设计 PKN 活性传感器 ExRai-PKNAR

研究人员运用改良的 KESTREL 方法，以小鼠成纤维细胞系 NIH3T3 的裂解液为潜在底物来源，使用昆虫细胞表达的 PKN₂催化结构域进行反应。通过放射性标记和质谱分析，发现来自小核糖体亚基蛋白 eS27 的磷酸肽被显著富集，于是以此为基础，经过对肽段的改造，将其替换到 ExRai-AKAR₂中，构建出新型 PKN 活性报告基因 ExRai-PKNAR。该传感器基于 ExRai 技术，能够在 PKN 激活并磷酸化底物肽时，通过检测 480nm 和 380nm 激发光下的荧光发射比率变化来反映 PKN 的活性。

表征 ExRai-PKNAR

在 HEK293T 细胞中，研究人员对 ExRai-PKNAR 进行了一系列表征实验。用佛司可林（forskolin）/3 - 异丁基 - 1 - 甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，Fsk/IBMX）刺激细胞诱导 PKA 活性，结果显示 ExRai-PKNAR 无响应，而 ExRai-AKAR₂有强烈反应；用佛波醇 12,3 - 二丁酸酯（Phorbol 12,3-dibutyrate，PBDu）刺激激活 PKC，ExRai-PKNAR 同样无反应，表明该传感器对 PKA 和 PKC 活性不敏感，特异性良好。将 ExRai-PKNAR 与 PKN 家族成员的催化结构域共转染，发现其 488/405nm 激发比率显著高于阴性对照，说明它能响应过表达的 PKN 活性。使用 PKN₂化学抑制剂处理细胞，表达 ExRai-PKNAR 和野生型 PKN₂的细胞，其传感器读数随时间明显降低，且免疫沉淀 - 体外磷酸化实验结果与传感器读数相符，进一步验证了 ExRai-PKNAR 能有效检测细胞中过表达 PKN 激酶的活性变化。

ExRai-PKNAR 揭示 PKN₂在质膜上的持续基础活性

研究人员构建了质膜靶向的 ExRai-PKNAR（PM-ExRai-PKNAR），通过免疫荧光染色发现内源性 PKN₂在 HEK293T 细胞中既分布于细胞质，也定位在质膜。使用 PKN₂抑制剂处理细胞后，非靶向的 ExRai-PKNAR 和无活性的膜靶向传感器（PM-ExRai-PKNAR^TA）读数无明显变化，而 PM-ExRai-PKNAR 读数显著下降，这表明在基础条件下，细胞质中 PKN₂活性较低，质膜是 PKN₂的活性热点，存在不同的 PKN₂活性池，可能存在区域特异性的调节机制。

评估不同底物识别策略对 PKN₂生物传感器的影响

研究人员将基于 KESTREL 方法获得的肽与另外两种底物选择方法进行比较，包括基于丝氨酸 / 苏氨酸激酶特异性图谱预测的最佳 PKN₂底物和先前生物化学验证的源自 CLIP - 170 蛋白的 PKN 底物肽。在计算预测中，前者效率得分较高，KESTREL 衍生肽次之，CLIP - 170 肽最差。但在活细胞实验中，PKN₂抑制剂处理后，KESTREL 衍生肽的生物传感器信号变化最大且最稳定，验证了改良 KESTREL 方法在选择适合生物传感器的底物肽方面的有效性。

在结论与讨论部分，此次研究成功开发了 ExRai-PKNAR 生物传感器，它能够特异性、灵敏地检测 PKN 家族激酶的活性，为研究 PKN 信号通路提供了有力工具。同时，研究还揭示了 PKN₂在质膜上存在持续的基础活性，这一发现有助于理解 PKN₂在细胞过程中的作用机制，以及其在胚胎发育等过程中的重要性。此外，研究人员使用的改良 KESTREL 方法在识别底物肽方面效果显著，为开发其他未被充分研究的激酶生物传感器提供了可行策略。这一研究成果发表在《Communications Biology》上，为生命科学和健康医学领域在激酶研究方面打开了新的大门，有望推动对细胞信号通路的深入理解，为相关疾病的治疗和药物研发提供新的思路和靶点。