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为探究 DDX1 在非剪接体剪接中的功能，研究人员构建 DDX1 条件性敲除（cKO）U2OS 细胞。结果显示，DDX1 缺失显著干扰含内含子 tRNA 剪接，却不影响 XBP1 mRNA 剪接。这揭示了 DDX1 对 tRNA 剪接的特异性需求，为相关研究提供新视角。
在生命的微观世界里，RNA 的剪接过程就像一场精密的分子机器运作。其中，非剪接体剪接对 tRNA 和 XBP1 mRNA 的加工至关重要，它关系到细胞的正常功能和生命活动的有序进行。然而，DEAD-box 解旋酶 1（DDX1）在这一过程中的角色却一直迷雾重重。尽管已知 DDX1 与 RNA 连接酶 2′,3′- 环磷酸和 5′-OH 连接酶（RTCB）形成复合物，参与 tRNA 和 X-box 结合蛋白 1（XBP1）mRNA 的非剪接体剪接，但它的具体作用及重要性尚不明确。而且，此前对 DDX1 在肿瘤发生等方面的研究，也未在分子层面彻底阐明其功能。在这样的背景下，深入探究 DDX1 在非剪接体剪接中的作用显得尤为迫切。
东京都医学科学研究所干细胞项目等研究机构的研究人员挺身而出，开启了这场探索之旅。他们通过构建 DDX1 cKO U2OS 细胞，深入分析 DDX1 在哺乳动物细胞中的功能。研究发现，DDX1 对含内含子 tRNA 的剪接至关重要，其缺失会导致 tRNA 剪接显著受阻；而内质网（ER）应激诱导的 XBP1 mRNA 剪接却不受影响。并且，只有具有酶活性的野生型 DDX1 能够挽救 tRNA 剪接缺陷，其解旋酶失活突变体则无能为力。这一系列结果表明，RTCB 对 tRNA 和 XBP1 mRNA 的剪接均不可或缺，而 DDX1 的酶活性仅在 tRNA 剪接中发挥关键作用。该研究成果发表在《Communications Biology》上，为深入理解 RNA 剪接机制提供了关键线索，也为相关疾病的研究和治疗开辟了新方向。
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是通过 CRISPR/Cas9 辅助的同源重组构建 DDX1 cKO U2OS 细胞，利用荧光原位杂交（FISH）、基因组 PCR、Southern blotting 等技术验证基因编辑效果；二是采用 Northern blotting 分析 tRNA 剪接情况，通过设计针对 tRNA 5′ 外显子或 3′ 外显子的寡核苷酸探针检测中间态和成熟态 tRNA；三是运用 qRT-PCR 和终点 RT-PCR 检测 XBP1 mRNA 的剪接水平；四是利用 Western blotting 检测相关蛋白的表达水平 。
研究结果
- DDX1 cKO U2OS 细胞的建立：研究人员采用一体化条件性敲除（cKO）方法，在多倍体人类骨肉瘤细胞系 U2OS 中构建 DDX1 cKO 细胞。FISH 分析显示 U2OS 细胞基因组中有四个 DDX1 位点。基因组 PCR 和 Southern blotting 结果表明，靶向载体高效整合到所有 DDX1 等位基因中。经 FLP 重组酶处理和 EGFP 阴性细胞分选，成功获得 DDX1 敲除（KO）细胞，且该细胞在敲除后至少 13 天内仍能存活 。
- DDX1 在非剪接体剪接中的功能：通过 Northern blotting 分析发现，DDX1 KO U2OS 细胞中含内含子 tRNA（如 Tyr-GTA、Ile-TAT、Leu-CAA 和 Arg-TCT）的中间态显著增加，而不含内含子的 Val-CAC tRNA 则未出现这种情况，表明 DDX1 对 tRNA 剪接至关重要。同时，在经衣霉素（ER 应激诱导剂）处理的 DDX1 KO 细胞中，终点 RT-PCR 和 qRT-PCR 检测结果显示，DDX1 缺失不影响 ER 应激诱导的 XBP1s表达及 XBP1s/XBP1u的比例，说明 DDX1 对 XBP1 mRNA 剪接并非必需。此外，RTCB 缺陷的 U2OS 细胞和 Archease 基因敲除细胞在 tRNA 和 XBP1 mRNA 剪接中均出现缺陷，进一步证明 RTCB 对两种 RNA 剪接均有作用，而 DDX1 具有特异性 。
- DDX1 酶活性在 tRNA 剪接中的需求：将野生型（WT）或 ATP 结合缺陷突变体（K52N）DDX1 导入 DDX1 KO U2OS 细胞，结果显示 WT DDX1 能够挽救 tRNA 剪接缺陷，而 K52N 突变体则不能，表明 DDX1 的酶活性对 tRNA 剪接是必需的。虽然 K52N 突变体与 WT 蛋白一样能维持 RTCB 复合物，但无法挽救剪接缺陷，说明 DDX1 并非仅通过维持复合物发挥作用 。
研究结论与讨论
该研究明确了 DDX1 在非剪接体剪接中的特异性作用，即 DDX1 活性对 tRNA 剪接至关重要，但对 XBP1 mRNA 剪接无明显影响。这一结果与以往认为 DDX1 参与 RTCB 鸟苷酸化以促进连接反应的观点不同，表明 DDX1 在 XBP1 剪接中可能并非通过鸟苷酸化发挥作用，而仅在 tRNA 剪接中参与 RTCB 的鸟苷酸化过程。
从机制上推测，DDX1 的解旋酶活性可能用于重塑切割后的 tRNA 末端结构，使其更适合 RTCB 催化的连接反应，而 tRNA 和 XBP1 mRNA 的结构差异或许是导致 DDX1 对 tRNA 剪接特异性需求的原因，也可能存在其他 RNA 解旋酶在 XBP1 剪接中补偿了 DDX1 的功能。此外，DDX1 KO 细胞中 RTCB 复合物的 FAM98B 和 CGI99 水平降低，暗示 DDX1 对维持复合物完整性具有一定作用，但具体机制有待进一步研究 。
值得注意的是，DDX1、RTCB 和 Archease 敲除细胞中仍存在一定量的成熟 tRNA，这表明可能存在替代途径参与中间态 tRNA 的连接。已有研究发现哺乳动物细胞中可能存在 5′- 磷酸连接途径，这一推测若得到证实，将为 RNA 剪接机制的研究开辟新的方向。
总的来说，这项研究为深入理解 RNA 剪接的分子机制提供了重要依据，DDX1 cKO U2OS 细胞系也为后续探究哺乳动物细胞中未明确的 tRNA 连接途径提供了有力工具，有望推动相关领域的进一步发展，为生命科学和医学研究带来新的突破 。
