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在环脂肽（CLPs）研究中，其脂肪酸链长度影响活性，且 iturin 家族脂肪酸链长度的决定机制不明。研究人员针对非核糖体肽合成酶（NRPSs）中酰基连接酶（AL）结构域展开研究，发现 AL 结构域决定脂肪酸链长度，为定制 CLPs 脂肪酸链提供依据。
在微生物合成领域，环脂肽（CLPs）宛如一群身怀绝技的 “小精灵”，它们由芽孢杆菌属产生，是一类兼具亲水氨基酸和疏水脂肪酸部分的两亲性分子。CLPs 依据结构不同，可分为表面活性素（surfactin）、丰原素（fengycin）和伊枯草菌素（iturin）三个家族 ，它们在抗菌、溶血等方面发挥着重要作用。其中，iturin 家族脂肽是由环七肽和 β - 氨基脂肪酸组成的环脂肽，展现出强大的抗菌活性。
然而，这些 “小精灵” 的脂肪酸部分长度不一，如同有着不同长度 “尾巴” 的小精灵，而这 “尾巴” 的长度又会影响它们的活性。例如，长脂肪酸链的 surfactin 溶血活性更高，长脂肪酸链的 iturin 和 mycosubtilin 抗菌活性更强。但长期以来，iturin 家族脂肽脂肪酸链长度的决定机制一直是个未解之谜，这就像隐藏在迷雾中的宝藏，吸引着科研人员去探索。
为了揭开这个神秘的面纱，来自日本 Kaneka Corporation 的 Agri - Bio Research Center、Gunma University Center for Food Science and Wellness 等多个研究机构的研究人员踏上了探索之旅。他们深入研究非核糖体肽合成酶（NRPSs）中酰基连接酶（AL）结构域，发现 AL 结构域在体内决定了 iturin 家族脂肽脂肪酸部分的长度，并且通过实验揭示了 AL 结构域底物结合口袋中氨基酸突变对体外底物特异性的影响。这一发现意义重大，为利用 NRPS 设计 CLP 合成的脂肪酰部分提供了关键信息，就像是为定制这些 “小精灵” 的神奇 “尾巴” 找到了一把精准的钥匙，极大地推动了定制脂肽活性技术的发展。该研究成果发表在《Communications Chemistry》上。
研究人员主要运用了定点突变技术，对 AL 和 ACP 结构域进行替换，构建一系列突变菌株，探究结构域与脂肪酸链长度的关系；采用蛋白质表达和纯化技术，获取重组蛋白，用于 AL 活性测定；利用结构预测技术，预测 AL 结构域三维结构，分析氨基酸突变对底物结合口袋的影响 。
研究结果
- 确定决定脂肪酸链长度的结构域：研究人员构建了含有不同来源 AL 和 ACP 结构域的突变菌株。通过对这些菌株产生的 mycosubtilin 同系物相对丰度分析发现，AL 结构域而非 ACP 结构域决定了 mycosubtilin 同系物的相对丰度。例如，含有 MycAL 的菌株主要产生 C17 同系物，含有 ItuAL 的菌株主要产生 C15 同系物。
- 明确决定脂肪酸链长度的氨基酸残基：对比 MycAL 和 ItuAL 的氨基酸序列，构建不同区域替换的嵌合 AL 结构域突变菌株。结果显示，区域 2、3 和 4 的氨基酸残基决定了脂肪酸部分的长度。进一步对这些区域进行单个氨基酸替换突变，发现 F208L、K287R 和 A332T 突变可改变 mycosubtilin 同系物的相对丰度，其中 F208L 影响尤为显著。在 iturin 合成酶中引入这些突变，同样改变了 iturin 同系物的相对丰度，且突变组合存在协同效应。
- F208 位点饱和突变研究：对 F208 进行饱和突变，发现替换氨基酸侧链原子数与 iturin 同系物中 C17 及更大脂肪酸同系物的相对丰度相关。侧链原子数小于等于 3 的氨基酸替换，有利于 C17 及更大脂肪酸同系物的产生；侧链原子数大于 3 的氨基酸替换，对其产生有不同影响。此外，部分突变菌株产生了新的 C19 同系物。
- AL 结构域活性测定：制备野生型 ItuAL_WT 和 F208G 突变体与 mycosubtilin 合成酶 ACP 结构域的融合蛋白，测定其对不同链长脂肪酸的相对酰基连接酶活性。结果表明，ItuAL_WT 对月桂酸（C12）活性最高，ItuAL_F208G 对十五烷酸（C15）活性最高 ，且 ItuAL_F208G 对 C15 异构体的活性均高于 ItuAL_WT。
- AL 结构域的结构预测：利用 ColabFold 预测 ItuAL 的三维结构，发现 F208 构成底物结合口袋并影响其深度，K287 和 A332 虽不参与口袋形成，但可能间接影响口袋形状。F208G 突变使底物结合口袋深度增加，有利于长链脂肪酸结合。
- 不同脂肪酸链组成的 iturin 活性研究：从不同菌株中提取 iturin，测定其对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和致病真菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）的抗真菌活性以及溶血活性。结果显示，脂肪酸链越长，iturin 的抗真菌活性和溶血活性越高，如 C19 - ITU 的抗真菌和溶血活性均高于 C15 - ITU。
研究结论与讨论
本研究明确了 AL 结构域在体内决定 iturin 家族脂肽脂肪酸部分的长度，且 AL 结构域氨基酸替换可改变体外底物特异性。这一发现不仅详细描绘了 AL 结构域的特异性特征，还表明修饰 AL 结构域是调控脂肽脂肪酸部分组成的有效策略，结合培养条件可生产更多样化的脂肽组合物。
研究还发现，AL 结构域底物特异性与细胞内脂肪酸库的匹配程度会影响脂肽的产量。在富含 C15 脂肪酸的细胞环境中，偏好 C15 脂肪酸的 MycAL 型 AL 结构域能更高效利用底物，提高产量。因此，未来可通过基因工程改造脂肪酸供应途径或添加特定脂肪酸来进一步提高产量。
此外，研究证实了 iturin 脂肪酸链越长，抗菌活性越高。本研究成功制备出此前未见报道的 C18 和 C19 脂肪酸链的 iturin 同系物，这些新的 iturin 组合物有望成为新型抗菌材料。若能通过进一步修饰 AL 结构域制备出更长脂肪酸链的 iturin，可能获得抗菌活性更高的材料，但同时需考虑脂肪酸供应问题。
总之，本研究揭示了 AL 结构域底物特异性决定 iturin 家族脂肽脂肪酸链长度的机制，为合理改变 NRPS 合成脂肽的脂肪酸链长度提供了理论依据。结合已有改变脂肽氨基酸部分的技术，未来有望根据不同应用需求自由定制脂肽。
