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本文利用液相透射电镜（LCTEM），通过序贯引入溶剂的方法，实现对电子束敏感的手性有机分子反溶剂结晶（ASC）的实时观察。该研究为探究复杂化学过程提供新平台，有助于优化活性药物成分（API）生产，推动相关领域发展。
引言
液相透射电镜（LCTEM）是研究液体中材料生长过程的有力技术，能实时且以原子空间分辨率进行观测。常见的成像方式是将少量液体封装在两个电子透明层之间形成液体池（LC）。然而，在混合两种前驱体溶液时探测液体中的现象极具挑战。此前的方法，如使用特定的液体池设计或在显微镜外预混合液体，都存在局限性，难以清晰观察溶液混合瞬间的重要反应，且对电子束敏感标本的研究能力有限。本研究旨在开发一种新的 LCTEM 方法，实现两种液体的混合，并能在扫描透射电子显微镜（STEM）模式下跟踪电子束敏感材料的生长动力学，以探究反溶剂结晶（ASC）过程。
结果与讨论
- 材料与非原位表征：手性在药物开发中至关重要，R - BINOL - CN 作为一种手性分子，被用于研究 ASC。以氯仿为溶剂，甲醇为反溶剂，添加甲醇会使 R - BINOL - CN 溶液过饱和，引发成核和结晶。非原位透射电镜（TEM）和场发射扫描电子显微镜（FESEM）研究表明，R - BINOL - CN 在氯仿和甲醇混合溶液中会自组装成不同形态的颗粒，如微球、微荚和微棒，且颗粒大小和形态受溶液老化时间和甲醇添加量影响。初步非原位 TEM 研究还发现，颗粒多为单个球体，部分已形成二聚体和微荚，且颗粒为结晶态。
- LCTEM 中的液体混合：多数商业 LC holders 基于浴缸设计，如 DENSsolutions Ocean holder，在进行涉及挥发性溶剂的实验时存在问题，如溶剂挥发快、液体混合难以控制、成像时液体厚度不易调节等。因此，本研究选用 DENSsolutions Stream holder，其液体流动路径限定在特定通道，能更好地控制液体厚度，提高图像对比度。在实验中，先将 R - BINOL - CN 的氯仿溶液缓慢引入 Nano - Cell，待液体充满观察区域后，反向流动使部分液体附着在窗口，再将 holder 插入显微镜，以 2 μL/min 的速率从出口阀引入甲醇，在 STEM 模式下记录粒子形成和生长动态。
- 反溶剂结晶的 LCTEM 研究：实时观察发现，甲醇进入观察区域后，R - BINOL - CN 粒子瞬间成核生长。通过对粒子生长过程的跟踪分析，发现粒子生长存在单体附着和聚并两种方式，且最终形成的微荚由大小相近的粒子组成。统计分析多个沉淀事件视频可知，粒子数量在开始时略有增加，随后保持稳定，粒子生长速率较慢，初始和最终粒子尺寸分布相似，证实了该方法适用于全面表征 ASC 过程，也表明 LCTEM 方法有助于优化 API 生产。
- 无反溶剂时的生长动力学：研究 R - BINOL - CN 在无甲醇时的生长动力学发现，电子束能量可使粒子成核，粒子生长主要通过单体附着和奥斯特瓦尔德熟化（OR）过程。大粒子会由球形变为盘状，最终聚并成单个大粒子。与有反溶剂时形成微荚的情况对比，凸显了反溶剂在结晶过程中的关键作用。
- 纳米级粒子附着的可视化：非原位图像显示存在长链状的自组装结构，为探究其形成机制，在体外向 R - BINOL - CN 的氯仿溶液中添加少量甲醇并引入显微镜观察。发现粒子在溶液中自由移动，相互接触后会经历重排再附着，附着过程分多个阶段。通过非原位低剂量衍射研究，发现粒子边缘部分区域存在结晶性，结合其他研究结果推测，沿特定晶面的取向附着（OA）可能是自组装的原因，但还需进一步研究证实。
结论
本研究开发的方法可在 TEM 中序贯引入两种溶剂，实现对电子束敏感的手性有机分子反溶剂结晶的实时可视化。该 LCTEM 方法为涉及试剂混合的反应提供了实时成像的新途径，有助于深入理解软材料的自组装过程，推动相关科学领域的发展。同时，STEM 模式下低剂量电子显微镜的高信噪比，能准确分析电子束敏感有机晶体的生长，相比传统 TEM 模式具有优势。未来有望开发更精确的芯片上流动通道，进一步提高实验精度。
方法
本研究使用 DENSsolutions B.V. 的商业液体流动 holder（Stream）和液体池（Nano - Cell）进行实验。Nano - Cell 由两个芯片组成，形成封闭的流体腔室，上下芯片分别有特定设计，保证液体流动和防止泄漏。实验时，通过切换进液和出液顺序在观察区域混合试剂，使用注射器泵控制液体流动。所有液体池实验在 JEM - F200 多功能分析 S/TEM 上进行，低剂量 4D - STEM 测量在 TESCAN TENSOR 4D STEM 上完成。R - BINOL - CN 分子通过铃木耦合反应合成，具体实验方法和数据分析详见补充信息。
