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为解决 Stargardt 病 1 型（STGD1）因 ABCA4 基因双等位基因变异致视网膜病变问题，研究人员开展针对 ABCA4 基因 c.768G>T 变异的剪接调节疗法研究。筛选出 A7 21-mer，能有效纠正剪接缺陷，为治疗带来希望。
在浩瀚的生命科学领域，眼睛作为心灵的窗户，一直是科研人员重点关注的对象。有一种令人揪心的遗传性视网膜疾病 ——Stargardt 病 1 型（STGD1），它如同隐匿在暗处的 “视力杀手”，悄然威胁着人们的视觉健康。这种疾病在人群中的发病率约为 1:10,000，患者最初会出现中心视力下降，随着病情的发展，最终可能完全失明，给患者的生活带来了极大的痛苦和不便。
STGD1 的 “罪魁祸首” 是 ABCA4 基因的双等位基因变异。ABCA4 基因编码的 ATP 结合盒亚家族 A 成员 4（ABCA4）蛋白，是视网膜光感受器细胞中的一种跨膜蛋白，它肩负着清除视觉循环中有毒副产物的重要使命，如 N - 视黄醛 - N - 视黄醇乙醇胺。一旦 ABCA4 蛋白功能失调，这些有毒化合物就会在光感受器和视网膜色素上皮细胞中堆积，最终导致细胞变性。目前，已发现超过 2400 种不同的 ABCA4 变异，其中一种位于外显子 6 - 内含子交界处的 c.768G>T 变异较为常见，在数千例 STGD1 患者中都能检测到。这个变异可别小看，它位于 ABCA4 外显子 6 的最后一个核苷酸，会降低原剪接位点的强度，导致外显子 6 延长 35 个核苷酸，从而引发移码突变，使蛋白质功能丧失。
面对 STGD1 带来的严峻挑战，荷兰 Radboud 大学医学中心等机构的研究人员挺身而出，开展了一项针对 ABCA4 基因 c.768G>T 变异的剪接调节疗法的研究。他们的研究成果发表在《Communications Medicine》上，为攻克这一难题带来了新的曙光。
研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。他们从携带 c.768G>T 变异的患者身上获取诱导多能干细胞（iPSCs） ，将其分化为光感受器前体细胞（PPCs）和视网膜类器官（ROs），以此构建疾病模型。之后，设计并合成了 25 种 2’ - O - 甲氧基乙基反义寡核苷酸（2’MOE/PS AONs） ，通过电穿孔法将其导入细胞和类器官中。运用定量聚合酶链反应（qPCR）、逆转录聚合酶链反应（RT - PCR）、蛋白质免疫印迹（Western blot）、免疫组化等技术，对 AONs 的效果进行评估。同时，利用 RNA 测序（RNA - seq）分析潜在的脱靶效应，通过外周血单个核细胞（PBMC）刺激试验检测免疫刺激情况，使用乳酸脱氢酶（LDH）释放试验评估细胞毒性。
AON 筛选
研究人员设计的 25 种 AONs 覆盖了几乎整个外显子延长区域，包括新的剪接位点。在 PPCs 中进行初步筛选，根据野生型（WT）转录本的检测情况，挑选出 10 种最有效的 AONs 。随后在 ROs 中进一步测试，结果发现 A7 表现最为突出，其 WT 转录本百分比最高。进一步缩短 A7 的 3′端进行测试，发现 21 - mer 版本的 A7 在纠正剪接缺陷方面效果最佳，能以剂量依赖的方式降低异常转录本水平。在研究过程中，还意外发现一种较小的转录本，经测序证实是 ABCA4 外显子 6 的部分缺失（c.673_768del） 。这种转录本虽然不会经历无义介导的衰变，但会影响 ABCA4 的 ATP 酶活性。
ABCA4 蛋白表达的恢复
研究人员推测，治疗时间可能会影响 AONs 在蛋白质水平上的纠正效果。于是，他们将 AONs 导入 ROs，并在不同时间点收获样本。结果发现，治疗时间对 RNA 水平的纠正效率没有影响，但在蛋白质水平上却有显著差异。经过 30 天的治疗，A7 21 - mer 处理的 ROs 中 ABCA4 蛋白表达量相对于同基因对照达到了 50% ，而未处理和用正义寡核苷酸（SON）处理的患者来源 ROs 中 ABCA4 蛋白几乎不表达。免疫组化分析显示，经 A7 21 - mer 处理 30 天后，ABCA4 蛋白在 ROs 的外段表达，与同基因对照相似。这表明 AONs 能够有效挽救由 ABCA4 c.768G>T 变异引起的剪接缺陷，其中 A7 21 - mer 效果最为显著。
先导候选 AON 的稳定性和全身暴露
研究人员发现，单次将 AONs 导入 ROs 后，在体外 60 天仍能观察到纠正效果，这充分证明了 AONs 在体外的稳定性。通过原位杂交和基于探针的 ELISA 实验，发现 A7 21 - mer 在体内同样具有良好的稳定性。在 C57BL/6 J 小鼠眼内注射 A7 21 - mer 后，1 周内可在所有视网膜层检测到该 AON ，且在注射后 12 周仍能在视网膜中检测到。不过，A7 21 - mer 在注射 6 小时后就从血浆中清除，同时在脾脏、肝脏和肾脏中也能检测到其存在。
先导候选 AON 的安全性
安全性是药物研发的关键环节。RNA 测序结果显示，用 A7 21 - mer 或其 SON 处理的 ROs 转录组谱非常相似，没有发现显著差异表达的基因。差异剪接分析也未发现 A7 21 - mer 会导致潜在的可变剪接事件。通过计算机预测潜在脱靶效应，发现其影响有限。在 PBMC 刺激试验中，A7 21 - mer 不会诱导显著的细胞因子和趋化因子释放，其免疫刺激谱与已在人体中应用的 Ultevursen 相似。此外，A7 21 - mer 在体外和体内均未表现出明显的细胞毒性和不良应激反应。
研究人员成功筛选出针对 ABCA4 基因 c.768G>T 变异的先导候选 AON——A7 21 - mer。它在转录水平和蛋白质水平上都能有效纠正剪接缺陷，且在体内外具有良好的稳定性和安全性。虽然目前还存在一些局限性，如缺乏合适的体内模型来评估 ABCA4 蛋白恢复对表型的影响，但这一研究成果无疑为 STGD1 的治疗提供了新的方向和希望。后续进一步的优化和体内研究，有望将这种治疗方法推向临床，为众多 STGD1 患者带来重见光明的可能。
