以时空视角探究胰腺的器官发生

　　

近期，来自贝勒医学院的 Marissa A. Scavuzzo 等人在《Experimental & Molecular Medicine》期刊发表了题为 “Pancreatic organogenesis mapped through space and time” 的论文。这项研究对胰腺发育过程中细胞的空间组织和相互作用进行了深入剖析，为了解胰腺器官发生机制提供了关键线索，在再生医学和糖尿病治疗研究等领域具有重要意义。

一、研究背景

器官形成依赖多种细胞类型的协同作用，细胞在器官发生过程中需遵循特定的几何协调方式。胰腺发育中，上皮细胞与周围微环境的信号和结构相互作用，对胰腺细胞的增殖、分化和组织构建至关重要。其中，间充质是胰腺微环境的重要组成部分，其在胰腺发育中的作用已被认知数十年，但间充质如何调控胰腺分化仍有待深入研究。此外，胰腺微环境中的内皮细胞和神经也参与胰腺发育，然而不同间充质亚型是否在空间上有序排列并影响上皮细胞命运及微环境组织，尚未明确。基于此，研究人员提出假设：胰腺发育过程中，异质性的间充质亚型会在特定位置聚集。

二、研究材料与方法

（一）实验动物

实验动物为多种基因编辑小鼠，包括 Nkx2-5-cre 小鼠、Wt1-creERt2 小鼠、Pdgfra-cre 小鼠、Sun1-sfGFP 小鼠和 ROSA mTmG 小鼠等。动物实验获得贝勒医学院机构动物护理和使用委员会等机构批准，小鼠饲养于特定环境，按标准流程进行基因分型。为研究细胞谱系，对特定小鼠进行他莫昔芬（tamoxifen）腹腔注射处理。

（二）组织处理与成像

2D 组织处理与成像：小鼠胰腺经 4% 多聚甲醛固定、蔗糖处理后包埋切片，进行免疫荧光染色，用 DAPI 染核，在蔡司 710 和尼康 A1Rsi 共聚焦显微镜下成像。

3D 组织处理与成像：取胚胎小鼠上消化道区域，经固定、组织透明化处理后，进行免疫染色，再用 DAPI 染色，最后在蔡司 Lightsheet Z.1 显微镜下成像。

人胰腺组织处理：在获得伦理批准后，对人胎儿胰腺样本进行固定、包埋切片，染色流程与小鼠冰冻切片相同。

（三）数据分析

空间映射：利用 Imaris 软件对 3D 图像进行处理，通过标记物阳性细胞的分割获取细胞坐标，计算欧氏距离并进行空间映射和主成分分析，以研究细胞间的空间关系。

单细胞 RNA 测序分析：运用 Seurat、Harmony、Monocle3 等工具对单细胞 RNA 测序数据进行处理，包括聚类分析、亚聚类分析、伪时间分析和互作组分析等，以探究细胞的转录特征和发育轨迹。

其他实验技术：还使用了流式细胞术进行细胞分选，提取 RNA 并构建文库进行测序，通过统计分析计算 P 值评估实验结果的显著性。

三、研究结果

（一）小鼠胚胎胰腺中存在多种间充质亚型

研究人员通过对先前单细胞 RNA 测序数据的重新分析，鉴定出四种间充质亚型（Mes1-4）、两种间皮亚型（MesO1/2）和一群胰腺星形细胞（PaSC）。进一步亚聚类后得到五个转录上不同的间充质细胞簇：Mes1、Mes2、Mes3/4、间皮细胞（MesO）和胰腺星形细胞（PaSC）。各个亚型具有独特的基因表达特征，比如 Mes1 表达与神经元生长和血管生成相关基因，Mes2 高表达血管生成相关基因等。

（二）间充质亚型形成具有独特空间分布的邻域

通过免疫荧光染色，研究发现间充质亚型在发育中的胰腺并非随机分布。例如，Mes1 亚型靠近胰腺上皮和胰岛素阳性（Ins+）细胞簇；Wt1+ 的 MesO 亚型位于胰腺外周。基因本体（GO）分析表明不同间充质亚型在功能上存在差异，分别富集于细胞迁移、上皮分化、血管发育等不同过程。

（三）外周间皮产生其他间充质亚型

基于 FGF 信号在胰腺发育中的重要性及 MesO 亚型高表达 FGF 配体的特点，研究人员推测 MesO 可产生其他间充质细胞类型。通过 Monocle 3 进行轨迹分析，发现 MesO 细胞处于拟时间轨迹的起始位置。利用 Wt1-creERt2 和 Rosa-mTmG 小鼠进行谱系追踪实验，证实了 Wt1+ 细胞可分化为不同的间充质亚型。此外，研究还发现不同时间点的间充质亚型在转录水平上存在差异，表明其功能可能随时间变化。

（四）胰腺微环境细胞的时空分析

研究人员在胰腺发育的三个时间点（e12.5、e14.5 和 e16.5）对小鼠胃肠道区域进行解剖和光学透明化处理，通过免疫染色和光片显微镜成像研究间充质亚型的 3D 空间组织。结果显示，Wt1+ 的 MesO 细胞在胰腺发育过程中始终位于外周，且在 e16.5 时与上皮细胞的距离显著缩短；Ace2+ 的 Mes3/4 细胞与 beta 细胞在胰腺发育过程中关系密切，且部分 Ace2+ 细胞在 e16.5 时靠近神经元；Mes2 细胞与内皮细胞紧密相连，且与 beta 细胞和内皮细胞的空间关系在发育过程中发生变化。

（五）间充质亚型与胰腺其他细胞类型的相互作用预测

通过构建发育中胰腺的细胞间相互作用图谱，研究发现间充质亚型与其他细胞类型之间存在复杂的信号通路。例如，Mes2 是血管内皮生长因子（VEGF）信号的来源，可作用于内皮细胞促进血管生成；间充质细胞还可通过多种配体 - 受体对调节胰腺神经发生等过程。

（六）人胰腺发育过程中的间充质亚型

利用公开的人胎儿胰腺单细胞 RNA 测序数据集，研究人员发现人胰腺发育过程中也存在间充质异质性，且部分间充质亚型与小鼠胰腺间充质亚型具有保守性。通过免疫染色和轨迹分析，进一步证实了人胰腺间充质亚型的存在及其在发育过程中的变化。

四、研究结论与讨论

（一）研究结论

本研究通过单细胞 RNA 测序、空间映射和谱系追踪等技术，系统地解析了胚胎胰腺间充质的异质性，鉴定出多种转录上离散的间充质亚型，并揭示了它们在胰腺发育过程中的时空分布规律和相互作用关系。研究表明，间充质亚型不仅在分子特征上存在差异，其在发育中的胰腺中的定位也各不相同，且不同亚型在胰腺发育的不同阶段发挥独特作用。

（二）讨论

间充质细胞对上皮发育的影响已逐渐受到关注，但以往研究多聚焦于间充质与内分泌分化的关系，而间充质对胰腺中神经和血管等其他细胞类型发育的影响常被忽视。本研究中，研究人员不仅对间充质亚型进行了深入的转录组分析，还绘制了其空间分布图谱并分析了配体-受体相互作用组，为理解胰腺器官发生过程中的组织构建和结构形成提供了更全面的视角。

研究发现 Wt1+ 的 MesO 间充质亚型在小鼠胰腺发育过程中形成外周间皮，且可产生其他间充质细胞类型，同时还揭示了 MesO 通过分泌 FGF 等配体对胰腺发育产生重要影响。此外，Mes3/4 亚型可能在胰岛神经支配过程中发挥桥梁作用，而 Mes2 亚型则在建立内分泌-内皮轴中具有关键作用。

（三）研究意义

这项研究成果为深入理解胰腺器官发生机制提供了重要依据，有助于推动再生医学领域中功能性人胰岛或胰腺类器官的工程构建和长期维持研究。通过明确不同间充质亚型在胰腺发育中的作用，有望为糖尿病等疾病的治疗提供新的靶点和策略。

然而，研究也存在一定局限性，如需要进一步开展细胞分选、消融和移植实验以明确间充质亚型的功能，同时还需挖掘更多罕见的间充质亚型，并深入研究细胞类型几何协调的驱动信号等。未来研究可在此基础上，进一步探索胰腺发育的精细调控机制，为相关疾病的治疗和再生医学的发展提供更坚实的理论基础。