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在基因治疗中，rAAV 载体用于肝脏基因转移时效果存争议。研究人员对 6 只非人灵长类进行 1 年随访，研究 rAAV8 载体介导的基因转移。结果发现，基因转移后肝脏出现炎症、纤维化等，这为理解 rAAV 介导基因转移的免疫反应提供依据。
在基因治疗领域，重组腺相关病毒（rAAV）载体凭借诸多优势，成为体内基因治疗的热门选择，被广泛应用于多种疾病的临床试验，如视网膜营养不良、肝脏疾病、神经系统及肌肉疾病等。然而，随着基因治疗研究的深入，rAAV 载体在高剂量全身静脉给药时暴露出一些问题。在临床前模型和患者中，尤其是使用 8 型和 9 型血清型的 rAAV 载体时，会出现急性肝毒性等不良事件。同时，免疫系统对载体和转基因产物的反应也会影响基因治疗的效果。在肝脏基因治疗中，肝脏独特的免疫耐受环境既有利于某些基因的长期植入，但也可能为一些肝嗜性病原体提供可乘之机，导致慢性感染，引发肝脏纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌。而且，目前对于 rAAV 介导的肝脏基因转移后，转基因产物表达维持的机制以及免疫反应的具体过程仍知之甚少。为了解决这些问题，法国南特大学（Nantes Université）等机构的研究人员开展了相关研究，研究成果发表在《Gene Therapy》上。
研究人员用到的主要关键技术方法有：对 6 只非人灵长类（NHP）进行实验，获取实验动物的组织样本。通过定量聚合酶链反应（qPCR）检测载体在组织中的分布；运用酶联免疫斑点试验（ELISpot assay）分析针对 GFP 的免疫细胞反应；采用组织学分析和免疫组化技术观察肝脏组织的病理变化和细胞特征；还利用激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection）和实时定量 PCR（Real-time qPCR）对肝脏浸润细胞进行分析。
研究结果
- 外周细胞毒性 T 淋巴细胞反应与肝脏转基因表达的丧失：研究人员使用 IFNγ ELISPOT 试验检测了 1、2 队列猕猴外周血单个核细胞（PBMCs）对衣壳和 GFP 衍生表位的 T 细胞反应。结果显示，6 只动物中有 5 只对 AAV8 衣壳无 IFNγ 分泌，而所有动物对 GFP 转基因产物均产生强烈的 IFNγ 分泌反应。同时，通过 ELISA 试验发现，所有动物注射后血清中均检测到抗 GFP IgG 抗体。此外，1、2 队列动物丙氨酸转氨酶（ALT）出现早期短暂峰值，表明存在细胞毒性免疫过程，且携带 CMV 启动子的 rAAV 注射动物的 ALT 峰值更高、出现时间更早。随着时间推移，针对转基因产物的免疫反应导致肝脏中 rAAV 基因组拷贝数显著减少，GFP 表达也随之丧失123。
- 注射后至少一年内病毒基因组的持续存在、T 细胞浸润和慢性肝脏炎症迹象：尽管存在针对转基因产物的细胞免疫反应，但在注射后 9 个月至 1 年安乐死的所有灵长类动物肝脏中，仍检测到部分病毒基因组。1 队列中病毒基因组持续存在的同时，伴有主要位于门静脉周围的单核细胞浸润，部分动物肝脏出现纤维化，且 α - 平滑肌肌动蛋白（α - SMA）阳性的肌成纤维细胞也在纤维化部位被观察到。通过对 1、2 队列肝脏中 84 个与炎症相关基因的表达分析发现，一些炎症相关基因在注射后早期上调，部分基因在注射后 1 年仍可检测到，如趋化因子 CXCL9、CXCL11 等456。
- rAAV 注射后长达一年在肝脏组织中检测到浸润的耗竭 T 细胞：对肝脏进行免疫组化分析发现，在有浸润的动物肝脏中，门静脉周围主要存在 CD3? T 淋巴细胞，且大多数浸润区域不存在 Foxp3? CD4? T 细胞，而 PD - 1?细胞在大多数肝脏浸润区域被检测到。通过对微切割浸润细胞的 mRNA 水平分析进一步证实，PD - 1 在多数动物中过表达，而 FOXP3 表达较低7。
研究结论与讨论
研究表明，rAAV8 介导的基因转移会导致肝脏中转基因表达丧失，且在免疫反应后，肝脏中病毒基因组无法完全清除，这与慢性炎症和免疫反应相关，且持续时间至少 1 年。炎症信号的存在，如 IFN - γ 诱导的趋化因子等的升高，可能导致 AAV 基因组在肝细胞中失活，但也不能排除部分病毒基因组逃避了急性免疫反应。研究中还观察到一些非人灵长类动物出现纤维化，且肝脏中存在大量由 CD4?和 CD8? T 细胞组成的单核浸润细胞，PD - 1 在浸润的 CD3? T 细胞上过度表达，这些特征与人类慢性病毒感染相似。此外，该研究中未检测到肝脏中 CD4? FOXP3?细胞，这与以往部分研究结果一致。本研究为理解 rAAV 介导的基因转移在肝脏中的免疫反应机制提供了重要依据，有助于进一步优化基因治疗策略，同时也提示在基因治疗临床应用中，需密切关注肝脏毒性和免疫反应的潜在风险 。
