Rubisco酶生化图谱的系统解析：揭示CO2固定关键酶的进化与工程潜力

本研究针对自然界最丰富的CO2固定酶Rubisco（核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶）的催化效率瓶颈问题，通过构建大肠杆菌（Escherichia coli）耦合生长的高通量筛选系统，首次绘制了Rhodospirillum rubrum来源的Form II型Rubisco全氨基酸单点突变图谱。研究发现多个保守位点具有突变耐受性，并鉴定出罕见提升CO2亲和力（KC）的突变体，其特性接近植物Form I型Rubisco。该成果发表于《Nature》，为理解酶进化约束和人工改造提供了全新视角。

　　

作为地球上最丰富的蛋白质，Rubisco每年催化约1000亿吨碳的固定，但其缓慢的催化动力学（k_cat≈3-10 s^-1）和与氧气的副反应长期制约着光合作用效率。尽管过去数十年研究揭示了Rubisco在速率（k_cat）、CO₂亲和力（K_C）和特异性（S_C/O）间的复杂权衡关系，但传统生化检测通量限制阻碍了系统性探索。更关键的是，为何自然进化未能优化出更高效的Rubisco变体？这个谜题亟需从分子层面破解。

来自霍华德·休斯医学研究所（Howard Hughes Medical Institute）和加州大学伯克利分校（University of California, Berkeley）的Noam Prywes、David F. Savage团队开发了创新性研究策略。他们改造出依赖Rubisco存活的大肠杆菌Δrpi菌株——该菌株缺失磷酸核糖异构酶（RPI），仅在表达功能性Rubisco时才能利用甘油生长。通过将酶活性与细胞生长耦合，研究人员建立了迄今最全面的Rubisco序列-功能图谱。

关键技术包括：

1. 构建覆盖99%单氨基酸突变的Rubisco突变体文库（8,760/8,835）

2. 开发基于CO₂浓度梯度的生长选择系统（5%-0.02% CO₂）

3. 采用长读长测序（PacBio）和短读长测序（Illumina）追踪突变体丰度

4. 通过Michaelis-Menten模型拟合计算V_max和K_C参数

5. 结合体外酶动力学验证（分光光度法、放射性同位素法）

A map of the rubisco biochemical landscape

研究发现Rubisco结构域呈现显著差异的突变敏感性：活性中心（如K191、K166）和埋藏残基对突变高度敏感，而溶剂暴露区域耐受性强。引人注目的是，参与催化的移动环6（Loop 6）中，E331和E333等位点虽参与底物结合却表现出意外的高突变容忍度。

Characterization of rubisco variants

通过比较77个已知突变体的生长速率与文献报道k_cat值（r=0.93），验证了筛选系统的可靠性。72%突变具有有害效应，仅0.14%接近野生型活性。值得注意的是，免疫印迹显示部分"高活性"突变实际通过提高表达量而非催化效率实现。

Fitness variation across the structure

系统发育分析揭示保守性与突变耐受性呈负相关（r=-0.52），但发现G186等高度保守位点意外耐受突变。更惊人的是，M215-H257这对在Form II Rubisco中形成三级相互作用的残基，在Form I中完全缺失，暗示了亚型间的进化分异。

Affinity inferred by substrate titration

通过CO₂滴定获得5,687个突变体的动力学参数（65%文库覆盖率），发现V_max与K_C存在普遍负相关。特别鉴定出A102Y、V266T等罕见突变体，其K_C（53-87 μM）显著低于野生型（149 μM），接近植物Rubisco水平（35-50 μM）。体外验证显示V266T的K_C降低41%（87 vs 149 μM），但k_cat相应下降48%，且S_C/O保持不变，印证了速率-亲和力的权衡关系。

Conclusion

该研究首次证明：1）细菌Form II Rubisco可通过单点突变获得植物Form I特性；2）酶活性景观存在"崎岖"但可及的优化路径；3）关键参数间存在固有约束。这些发现不仅改写了对Rubisco进化限制的认知，更为设计高亲和力工程酶提供了新靶点（如C₂对称轴附近的A102、V266）。未来结合机器学习和高阶突变文库，或将突破自然进化的局限，创造适应不同环境的新型碳固定工具。