MDM2：调控有丝分裂时长与细胞周期的关键 “定时器”

在细胞研究领域，有丝分裂时长与细胞周期调控至关重要。为探究相关机制，研究人员以 hTERT - RPE1 细胞等为对象，研究 MDM2 在其中的作用。结果发现 MDM2 是有丝分裂 “定时器”，其浓度影响 p53 稳定性，进而调控细胞周期。这一成果为理解细胞周期调控提供新视角。

　　在细胞的生命历程中，有丝分裂是极为关键的阶段，它就像一场精密的 “舞蹈”，染色体有条不紊地分离，确保新生成的细胞拥有正确的遗传物质。然而，当这场 “舞蹈” 出现差错，有丝分裂发生延迟时，细胞就会面临严峻的考验。染色体不稳定、非整倍体等问题可能接踵而至，这些异常与肿瘤的发生发展紧密相关。在众多应对机制中，p53 依赖的细胞周期阻滞起着重要的保护作用，它能阻止受损细胞继续增殖，就像给失控的细胞踩下 “刹车”。但长期以来，这一调控机制背后的分子细节却如同迷雾，让科学家们困惑不已，尤其是在正常细胞中，其相关通路和分子组件的具体作用尚不明确。为了揭开这层神秘的面纱，英国牛津大学的研究人员展开了深入研究，相关成果发表在《Nature Cell Biology》上。

研究人员采用了多种关键技术方法。细胞实验方面，利用多种细胞系，如端粒酶永生化的视网膜色素上皮细胞（hTERT - RPE1），通过对其进行基因编辑、转染等操作构建不同模型，以研究细胞周期进程。蛋白和基因检测技术上，运用免疫印迹（Western blotting）分析蛋白表达和稳定性，采用定量逆转录聚合酶链反应（RT - qPCR）检测 mRNA 水平。同时，借助荧光成像和单细胞追踪技术，实时观察细胞周期各阶段的变化。

研究结果

1. 有丝分裂延迟引发 p53 依赖的 G1 期阻滞：研究人员借助荧光成像和单细胞追踪技术，对 hTERT - RPE1 细胞进行细致观察。他们发现，在正常生长条件下，多数 p53 野生型（p53^WT）细胞的有丝分裂能在 60 分钟内完成。当有丝分裂时间延长，超过 60 分钟时，75% ± 3% 的 p53^WT细胞会在 G1 期发生阻滞，且这种阻滞至少持续 27.9 ± 10.0 小时。而 p53 基因敲除（p53^KO）的细胞，即便有丝分裂时间超过 60 分钟，也不会出现 G1 期延长或细胞周期阻滞现象。这表明，有丝分裂存在一个关键的时间阈值，一旦超过，细胞就会启动 p53 依赖的 G1 期阻滞机制。此外，研究人员还用低剂量的微管毒药诺考达唑（nocodazole）干扰染色体排列，激活纺锤体组装检查点，进一步验证了有丝分裂延迟与 G1 期细胞周期阻滞之间的紧密联系，且该阻滞与 DNA 损伤无关。
2. MDM2 具备有丝分裂定时器的特性：MDM2 作为 p53 的 E3 泛素连接酶，对 p53 的稳定性起着关键调控作用。进入有丝分裂后，细胞内转录和翻译活动普遍减弱，MDM2 的合成也随之减少。研究发现，MDM2 在有丝分裂细胞中的半衰期约为 29 ± 6 分钟，其 mRNA 水平在进入有丝分裂 1 小时内迅速下降，且在长达 18 小时的有丝分裂阻滞过程中都未能恢复。通过用环丝氨酸（cycloheximide）阻断新蛋白合成，研究人员测量了不同细胞系中 MDM2 的稳定性，结果表明 MDM2 在多种细胞系中都具有较短的半衰期。同时，用³⁵S - 甲硫氨酸脉冲标记实验显示，有丝分裂细胞中 MDM2 的合成相较于异步培养细胞下降了 86% ± 7%。这些结果表明，MDM2 在有丝分裂过程中会快速减少，符合作为有丝分裂定时器的特性。
3. MDM2 在有丝分裂中催化自身降解：MDM2 的降解机制是其作为定时器功能的关键环节。研究表明，MDM2 的降解依赖于泛素化途径，且主要通过自身催化的泛素化实现。研究人员通过构建 MDM2 的点突变体（如 I440A 和 R479A），发现这些突变体能够阻止 E2 - 泛素结合，进而使 MDM2 稳定性增加。同时，联合敲低 MDM2 的 E2 酶 UBE2D2 和 UBE2D3，也会导致 MDM2 蛋白量显著增加和稳定性提高。此外，抑制蛋白酶体可稳定 MDM2，使其浓度随时间呈线性上升。而细胞周期中与有丝分裂和 G1 期相关的主要泛素连接酶，如后期促进复合物 / 细胞周期体（APC/C）和 Skp1 - Cullin - F - box（SCF），对 MDM2 的降解并无明显影响。这一系列实验充分证明，MDM2 在有丝分裂中能够催化自身降解，且其半衰期是固有属性，与经典细胞周期泛素连接酶无关。
4. MDM2 在有丝分裂中的降解导致 G1 期细胞周期阻滞：为了深入验证 MDM2 稳定性在有丝分裂定时器机制中的关键作用，研究人员使用了 MDM2 蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）试剂 MD - 224。在 hTERT - RPE1 p53^WT细胞中，用 MD - 224 处理后，MDM2 迅速被降解。当结合 1 小时或 4 小时的纺锤体检查点阻滞实验时，发现 1 小时的有丝分裂延迟，若同时存在 MD - 224，会使 p53 和 p21 显著增加，引发细胞周期阻滞和增殖丧失；4 小时的有丝分裂延迟，无论是否存在 MD - 224，都会导致细胞周期阻滞。而在 p53^KO细胞中，上述现象均未出现。这明确表明，MDM2 在有丝分裂中的降解是触发 p53 依赖的 p21 诱导和 G1 期细胞周期阻滞的关键因素。
5. 确定有丝分裂中 MDM2 引发 G1 期阻滞的阈值：研究人员通过单细胞追踪 hTERT - RPE1 p53^WT和 p53^KO FUCCI 细胞，详细分析了细胞周期路径。结果显示，即使是短暂的有丝分裂延迟，也会增加 p53^WT细胞在 G1 期阻滞的比例；添加 MD - 224 会进一步提高阻滞比例。缩短有丝分裂延迟时间或抑制 MDM2 活性，并不会导致 G1 期延长或细胞周期阻滞。通过滴定 MD - 224，研究人员确定了有丝分裂中 MDM2 的精确阈值，低于该阈值，p53 会稳定，进而诱导 p21 表达，最终导致细胞周期阻滞。
6. MDM2 过表达提高有丝分裂时间阈值：研究人员构建了稳定表达 GFP - MDM2 的 hTERT - RPE1 p53^WT细胞系（GFP - MDM2^OE）。与对照细胞相比，GFP - MDM2^OE细胞中 MDM2 表达量增加约 5 倍，其诱导核 p21 的阈值也相应提高。在有丝分裂定时器和细胞增殖实验中，GFP - MDM2^OE细胞在 4 小时有丝分裂延迟后，并未出现 p53 稳定、p21 诱导和细胞增殖阻滞现象。这表明，增加 MDM2 的稳态水平能够抑制有丝分裂定时器响应，进一步证实了 MDM2 浓度在调控有丝分裂时长检测机制中的关键作用。

研究结论与讨论

该研究明确了 MDM2 作为有丝分裂定时器的关键作用。由于其短半衰期以及有丝分裂中蛋白质合成的减弱，MDM2 浓度会随着有丝分裂时间延长而下降。当 MDM2 浓度低于特定阈值时，它对 p53 的调控作用减弱，导致 p53 稳定，进而诱导 p21 表达，使细胞在 G1 期发生阻滞。这一发现为 p53 依赖但 DNA 损伤信号无关的 G1 期细胞周期阻滞现象提供了合理的解释。在肿瘤细胞中，p53 功能常常因突变等原因丧失，这使得细胞能够逃避有丝分裂延迟引发的 G1 期阻滞，继续增殖，从而促进肿瘤的发展。该研究成果不仅为理解正常细胞如何检测非整倍体提供了新的视角，也为深入探究肿瘤细胞中基因组不稳定和不受控制的增殖机制奠定了重要基础，有望为癌症治疗开辟新的方向。