重大发现！FUT10 和 FUT11 改写蛋白质 O - 岩藻糖基化认知版图

在蛋白质 O - 岩藻糖基化研究领域，此前仅知 POFUT1 和 POFUT2 参与特定结构修饰。为探究新的修饰机制，研究人员开展 FUT10 和 FUT11 功能研究。结果发现二者是修饰蛋白 EMI 结构域的 POFUTs，参与非经典内质网质量控制。这拓展了 O - 岩藻糖基化认知，意义重大。

　　在生命科学的神秘世界里，蛋白质的修饰过程就像一场精密的分子舞蹈，其中蛋白质 O - 岩藻糖基化（Protein O-fucosylation）扮演着至关重要的角色。它参与了众多关键的生物学事件，从细胞的生长发育到疾病的发生发展，都有它的身影。此前，科学家们已经发现了蛋白质 O - 岩藻糖基转移酶 1（POFUT1）和蛋白质 O - 岩藻糖基转移酶 2（POFUT2），它们分别对表皮生长因子样重复序列（EGF-like repeats）和血小板反应蛋白 1 型重复序列（TSR）进行 O - 岩藻糖基化修饰，并且这些修饰与多种人类先天性疾病和癌症密切相关。然而，随着研究的深入，新的问题浮出水面：在 Multimerin-1（MMRN1）的弹性蛋白微原纤维界面（EMI）结构域上，发现了一种未被解释的 O - 岩藻糖基化修饰，它既不符合 POFUT1 的修饰模式，也与 POFUT2 的作用机制不同，那么究竟是哪种酶在背后操控这一修饰过程呢？这个谜团吸引着科学家们不断探索，也为新的研究拉开了序幕。

为了解开这个谜团，来自美国佐治亚大学复杂碳水化合物研究中心（Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia）和澳大利亚悉尼大学等多个研究机构的研究人员携手合作，展开了一项深入的研究。他们通过一系列严谨的实验，最终发现 FUT10 和 FUT11 实际上是负责修饰 EMI 结构域的蛋白质 O - 岩藻糖基转移酶（POFUTs），并将其重新命名为 POFUT₃和 POFUT₄。这一发现不仅拓展了蛋白质 O - 岩藻糖基化的研究领域，还为深入理解相关生物学过程和疾病机制提供了新的线索。该研究成果发表在《Nature Chemical Biology》上，引起了科学界的广泛关注。

在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是基于 AlphaFold2 的蛋白质结构预测和相互作用分析，这一技术帮助研究人员从分子层面预测 FUT10、FUT11 与 EMI 结构域之间的相互作用，为后续实验提供了重要的理论依据。其次，利用共免疫沉淀技术（co-immunoprecipitation）验证了它们之间的相互作用，直观地展示了这些蛋白质在细胞内的结合情况。此外，质谱分析（mass spectrometric analysis）在研究中发挥了关键作用，通过对蛋白质糖基化修饰的精确检测，确定了 O - 岩藻糖基化的位点和修饰程度。同时，CRISPR-Cas9 基因编辑技术构建基因敲除细胞系，明确了 FUT10 和 FUT11 在 O - 岩藻糖基化过程中的具体作用。

研究结果主要通过以下几个方面得出：

1. 确定修饰酶：研究人员通过在不同基因敲除的 HEK293T 细胞中表达 MMRN1，利用质谱分析发现 POFUT1 和 POFUT2 均不负责 MMRN1 EMI 结构域的 O - 岩藻糖基化。接着，借助 AlphaFold2-multimer 预测，发现 FUT10 和 FUT11 与 EMI 结构域有很强的相互作用，且通过共免疫沉淀实验进一步验证了这种相互作用。随后的体外酶活实验表明，FUT10 和 FUT11 能够独立地为 EMI 底物添加岩藻糖，且具有时间依赖性，从而确定它们是修饰 EMI 结构域的 POFUTs。
2. 酶活性分析：对 FUT10 和 FUT11 进行动力学分析，发现它们修饰 T216 和 T265 位点的催化机制相似，但 T216 位点的 Km（底物浓度在反应速度达到最大反应速度一半时的浓度）和 Vmax（最大反应速率）值比 T265 位点高。同时，GFP-FUT10 的总体活性显著高于 GFP-FUT11，但在低 EMI 底物浓度下，GFP-FUT11 在 T216 位点的活性略高，在 T265 位点活性相似。
3. 细胞内功能验证：通过 CRISPR-Cas9 技术构建 FUT10、FUT11 单敲除和双敲除的 HEK293T 细胞系，发现敲除 FUT10 或 FUT11 会显著降低 MMRN1 EMI 结构域的 O - 岩藻糖基化水平，双敲除则完全消除该修饰，而过表达 FUT10 或 FUT11 可恢复修饰，证明二者在细胞内负责 EMI 结构域的 O - 岩藻糖基化。
4. 修饰特性及细胞定位：研究发现 FUT10 和 FUT11 仅修饰折叠的 EMI 结构，且定位于内质网而非高尔基体。通过突变 MMRN1 的 O - 岩藻糖基化位点和在 FUT10/11 双敲除细胞中进行分泌实验，证实 O - 岩藻糖基化对 MMRN1 的分泌有重要影响，表明 FUT10 和 FUT11 参与内质网的质量控制，确保含 EMI 结构域蛋白的正确折叠和分泌。

研究结论和讨论部分指出，FUT10 和 FUT11（POFUT₃和 POFUT₄）是修饰 EMI 结构域的新型 POFUTs，它们在体外和细胞内都具有很强的 O - 岩藻糖基转移活性。与 POFUT1 和 POFUT2 类似，POFUT₃和 POFUT₄依赖折叠的 EMI 结构进行修饰，并参与内质网的非经典质量控制途径。这一发现纠正了此前对 FUT10 和 FUT11 功能的错误注释，拓展了蛋白质 O - 岩藻糖基化的研究范畴。同时，研究还发现 POFUT₃和 POFUT₄在脊椎动物发育中具有重要功能，其异常表达与肿瘤发生相关，这为研究胚胎发育、肿瘤发生和干细胞维持等生物学过程提供了新的靶点和理论依据，有望推动相关疾病的诊断和治疗研究取得新的突破，在生命科学和健康医学领域具有重要的意义。