工程化活细胞中共价小分子 - RNA 复合物：开启 RNA 研究与治疗新征程

在 RNA 研究中，共价 RNA 标记技术发展不足。为解决此问题，研究人员开展了工程化共价 RNA 适配体 - 配体复合物的研究。他们成功构建了共价 preQ1核糖开关系统和 coFLAP 系统，为 RNA 靶向药物设计提供了依据，推动了 RNA 研究和治疗领域的发展。

　　RNA 作为生命活动中的重要分子，在基因表达调控、基因组结构维持等方面发挥着关键作用，与多种人类疾病的发生发展密切相关。因此，深入研究 RNA 的功能并实现精准调控，对于揭示生命奥秘、开发新型治疗手段意义重大。目前，RNA 研究的进展依赖于精确的化学方法，但现有的 RNA 研究工具主要基于 RNA 与配体或受体的非共价结合，而共价 RNA 标记技术虽潜力巨大，却未得到充分探索。现有的共价 RNA 标记方法存在诸多问题，如活性探针功效低、反应速率慢、需光照激活等，严重限制了其在 RNA 研究中的应用。在此背景下，来自奥地利因斯布鲁克大学等机构的研究人员开展了相关研究，旨在探索新策略，实现小分子配体与 RNA 靶标的特异性共价连接，为 RNA 研究和治疗开辟新途径 。该研究成果发表在《Nature Chemical Biology》上，为 RNA 领域的发展带来了新的突破。

研究人员采用了多种关键技术方法。在 RNA 合成方面，通过固相合成法制备 RNA 寡核苷酸，并进行纯化和质量分析。对于配体与 RNA 的反应，分别在体外进行 preQ₁RNA 和 Pepper RNA 的烷基化反应，并利用多种手段分析反应产物。运用 FT - ICR 质谱（FT - ICR-MS）对 RNA 烷基化产物进行表征，确定烷基化位点和质量变化。此外，还使用了多种细胞实验技术，如在大肠杆菌中进行核糖开关活性测定，在人胚肾 293T（HEK293T）细胞中进行细胞转染、体内共价连接验证、成像分析等。

研究结果如下：

• 共价连接 preQ₁RNA 适配体：研究人员以 preQ₁ - I 核糖开关为研究对象，依据其 RNA 结合口袋结构，设计合成了含反应性手柄的配体 Brc₃DPQ₁。实验表明，Brc₃DPQ₁能与相应 RNA 适配体在近生理条件下高效反应，形成稳定的 RNA 加合物。通过一系列实验，研究人员系统研究了连接子长度、离去基团性质和潜在替代亲核试剂对反应的影响，确定了最佳反应条件和关键反应位点。
• 体内评估共价 preQ₁配体：为探究反应性 preQ₁配体对体内核糖开关调控特性的影响，研究人员构建了报告基因载体，在大肠杆菌中进行实验。结果显示，C15U 突变的核糖开关对修饰配体的响应与野生型不同，突变型可被 preQ₁及溴丙基修饰的 7 - 氮杂嘌呤配体有效调控，这为深入理解核糖开关的调控机制提供了新视角。
• 共荧光激活适配体（coFLAP）：鉴于传统荧光激活适配体（FLAPs）存在配体易洗脱、荧光信号不稳定等问题，研究人员开发了基于共价连接荧光团的新型 FLAP 系统 coFLAP。以 Pepper 适配体为例，设计合成的 Brc₃HBC 和 MsOc₃HBC 能与 Pepper RNA 高效共价结合，且 MsOc₃HBC - vinyl 还可用于亲和纯化交联的 RNA 靶标，为 RNA 研究提供了更强大的工具。
• 不同核酶烷基化化学的比较：研究人员对比了多种核酶烷基化系统，发现新开发的系统具有更高的催化效率，且在低 Mg^{2 +}浓度下仍具有活性，这使得共价配体 - 适配体系统在体内应用中更具优势。
• 细胞内配体与 Pepper 和 preQ₁RNA 适配体的连接：研究人员构建质粒在 HEK293T 细胞中表达 Pepper 和 preQ₁适配体，并与相应配体孵育。通过多种实验手段证明，配体可在细胞内与适配体高效共价连接，且对细胞生理影响较小，为在活细胞中研究 RNA 提供了有力支持。
• coFLAP 系统的应用：coFLAP 系统在活细胞成像中表现出色，经洗涤后仍能保留荧光信号，显著提高了信噪比。同时，该系统适用于超分辨率显微镜、荧光相关光谱（FCS）和荧光漂白恢复（FRAP）等技术，可用于研究 RNA 的定位和动力学，为深入了解 RNA 在细胞内的行为提供了重要手段。此外，coFLAP 系统还可用于生化下拉实验，实现对目标 RNA 的有效富集。
• 对 RNA 药物研发的意义：研究人员以与 preQ₁核糖开关结合的药物样化合物 DBF 为例，合成其溴丙基修饰衍生物 Brc₃DBF 并与 preQ₁RNA 适配体反应。结果表明，该方法可实现共价连接，为 RNA 靶向药物设计提供了新的思路和方法，推动了 RNA 药物研发领域的发展。

研究结论和讨论部分指出，本研究开发的共价连接小分子与 RNA 适配体的新策略，通过理性的结构引导设计，实现了高效、位点特异性的共价连接。新的共价配体 - RNA 对在细胞应用中展现出诸多优势，如提高成像灵敏度和选择性、用于 RNA 富集和研究 RNA - 蛋白质相互作用等。同时，该策略在 RNA 药物研发方面具有巨大潜力，有望将低至中等亲和力的结合物转化为功能性 RNA 抑制剂，为 RNA 靶向治疗提供更有效的手段。这一研究成果为 RNA 研究和治疗领域提供了重要的理论基础和技术支持，推动了该领域的进一步发展，为解决 RNA 相关疾病的治疗难题带来了新的希望。