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在药物研发中，明确膜蛋白 - 配体相互作用动力学至关重要。研究人员以视紫红质（rhodopsin）为模型，开展天然细胞信号环境中蛋白异构体特异性相互作用研究。结果发现不同蛋白异构体及修饰，还明确了药物脱靶结合情况。该研究为药物发现提供新思路。
在药物研发的征程中，理解膜蛋白与配体在天然脂质双分子层中的相互作用动态，犹如找到打开精准治疗大门的钥匙，是众多科研人员梦寐以求的目标。细胞是生命活动的基本单位，细胞内的蛋白质如同精密仪器中的各个零件，发挥着至关重要的作用。然而，蛋白质并非一成不变，它们会通过可变剪接和翻译后修饰（PTMs）产生大量独特的蛋白异构体（proteoforms） 。据估算，人类仅约 20,000 个蛋白质编码基因，却能产生几十万种蛋白异构体。这些蛋白异构体在细胞功能和疾病发生发展中扮演着关键角色，精准靶向特定的蛋白异构体有望实现个性化治疗，减少药物的脱靶效应。
但现实却给科研人员们出了一道难题。传统的细胞检测方法往往无法察觉蛋白质修饰带来的影响，就像戴着有色眼镜看世界，只能看到模糊的轮廓，却看不清细微之处。而基于质谱（MS）的蛋白质组学技术虽已成为研究蛋白异构体的常用手段，但无论是自下而上的蛋白质组学方法，还是自上而下的蛋白质组学方法，都存在一定的局限性，无法完美地揭示蛋白质修饰与蛋白质相互作用之间的直接联系。在这样的困境下，开展一项能够突破现有技术局限，深入研究天然细胞信号环境中蛋白异构体特异性相互作用的研究显得尤为迫切。
为了攻克这一难题，来自英国牛津大学等机构的研究人员挺身而出。他们以视紫红质这一典型的 G 蛋白偶联受体（GPCR）为研究对象，开展了一系列深入研究，并将研究成果发表在《Nature Chemistry》上。这项研究意义重大，它不仅为理解蛋白质在天然环境中的功能和调控机制提供了新的视角，更为药物研发开辟了新的道路，有望推动个性化医疗的发展。
在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，他们利用红外激光照射，从视网膜杆状细胞盘膜上可控地释放膜蛋白和相关蛋白，这一技术为后续的研究提供了重要的样本来源。接着，通过红外多光子解离（IRMPD）技术对释放的蛋白复合物及其蛋白异构体进行天然自上而下的测序，从而能够深入分析蛋白异构体的精细分子细节。此外，研究人员还运用了糖蛋白质组学、自下而上的液相色谱 - 质谱（LC - MS）等技术，对蛋白质的修饰和组成进行全面的分析。
研究结果主要分为以下几个方面：
- 释放膜和盘内蛋白：研究人员发现，不同功率的红外激光照射会导致脂质双分子层释放不同的蛋白质。较低功率激光照射时，能释放出被困在核心及与膜相关的蛋白质；较高功率激光照射时，则可使脂质双分子层消散，释放出完整的膜蛋白用于质谱分析。通过对质谱图中不同峰的分析，研究人员鉴定出了多种参与糖酵解、视觉光转导级联反应等过程的蛋白质，还发现了一些蛋白质的修饰情况。
- 视紫红质蛋白异构体的天然自上而下测序：视紫红质的蛋白异构体具有明显的异质性。研究人员通过对其 8+电荷态的详细分析，发现了多个对应不同修饰的卫星峰。利用 IRMPD 技术，他们成功获得了视紫红质的片段离子，确定了其 C 末端结构域的序列覆盖情况，还发现了一些修饰，如棕榈酰化、N - 连接糖基化等。尽管 N - 连接糖基化增加了序列离子分析的复杂性，但研究人员通过仔细分析，成功鉴定出了不同视紫红质蛋白异构体的修饰情况。
- 盘内细胞空间中的独特蛋白异构体：在对盘内细胞空间的研究中，研究人员发现了多种参与视紫红质信号传导的蛋白异构体。例如，鉴定出了磷脂酰乙醇胺结合蛋白 1（PEBP1）、钙调蛋白（CAM）等蛋白的不同修饰形式，还发现了 G 蛋白亚基的多种蛋白异构体，包括具有不同脂质修饰的 Gα 和 Gβγ 亚基，以及与这些亚基相关的不同蛋白复合物。此外，研究人员还对磷酸二酯酶 6（PDE6）进行了深入分析，发现了其亚基的脂质修饰以及与底物的结合情况。
- 单蛋白异构体水平的脱靶药物结合：研究人员选择了两种 PDE 抑制剂 —— 伐地那非（vardenafil）和西地那非（sildenafil），研究它们与视网膜 PDE6 的相互作用。结果发现，伐地那非能使 PDE6 的质量分布增加 976 Da，对应结合两个分子；而西地那非仅使 PDE6 质量增加 476 Da，即结合一个分子。进一步研究发现，两种药物都存在与 G 蛋白亚基的脱靶结合现象，且伐地那非与脂质修饰的 G 蛋白亚基结合更为显著。这表明脂质修饰可能增强了药物的脱靶结合，影响药物的副作用。
研究结论和讨论部分指出，该研究在天然自上而下的质谱技术上取得了重要进展，能够从天然脂质双分子层中直接释放 GPCR 及其效应器，并对其进行测序分析。研究人员观察到视紫红质的多种蛋白异构体以及它们的修饰情况，还发现了 G 蛋白和 PDE6 的多种脂质修饰形式，这些发现对于理解疾病发病机制具有重要意义。例如，PDE6 亚基的脂质修饰缺陷与视网膜杆细胞退化导致的失明有关； prenylation - deficient Gγ 蛋白异构体的发现，也为研究 G 蛋白在细胞信号传导中的作用提供了新的线索。此外，研究人员还揭示了两种 PDE5 抑制剂与脂质化蛋白的交叉反应，为药物研发中避免脱靶效应提供了重要参考。尽管目前天然自上而下的质谱技术仍面临序列覆盖率低、数据分析困难等挑战，但随着技术的不断创新和发展，有望在未来的药物研发和生物学研究中发挥更大的作用。这项研究为我们打开了一扇通往天然细胞信号环境中蛋白异构体研究的新大门，让我们对蛋白质的奥秘有了更深入的认识，也为未来的药物研发和疾病治疗带来了新的希望。
