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在神经系统研究中，caspase-3 在神经元凋亡中作用已被熟知，但它在突触修剪方面的功能尚不明确。研究人员开展了非凋亡性 caspase-3 在突触修剪和电路重塑中作用的研究，发现其能驱动小胶质细胞突触吞噬，影响神经元回路，为相关疾病研究提供新思路。
在大脑的奇妙世界里，神经元就像一个个精密的信号处理器，它们之间通过突触相互连接，形成了复杂而有序的神经网络。在大脑发育和神经功能维持过程中，突触修剪起着至关重要的作用，它就像一位 “园艺师”，精心修剪着神经元之间的连接，确保神经网络的正常运作。小胶质细胞作为大脑中的 “清道夫”，在突触修剪中扮演着关键角色。然而，长期以来，人们并不清楚在这个过程中，caspase-3（一种在神经元凋亡中发挥重要作用的蛋白酶）是否参与其中以及如何发挥作用。
为了解开这个谜团，来自日本国立精神神经医疗研究中心（National Institute of Neuroscience, National Center of Neurology and Psychiatry）和东京大学（The University of Tokyo）等机构的研究人员开展了深入研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们揭示了非凋亡性 caspase-3 在突触修剪和神经回路重塑中的关键作用，这一发现意义重大，为理解正常大脑功能以及神经发育和神经退行性疾病的发病机制提供了新的视角。
研究人员在本次研究中运用了多种技术方法。在细胞培养方面，通过神经元 - 神经胶质共培养体系模拟大脑微环境。利用病毒载体将相关基因导入细胞，实现基因编辑。借助免疫组化技术（immunohistochemistry），能够直观观察细胞内特定蛋白的表达和定位。实时定量 PCR（RT-qPCR）则用于精确检测基因表达水平的变化。此外，还采用了光遗传学（optogenetics）技术，通过光来精准控制特定神经元的活动，为研究 caspase-3 的功能提供了有力工具 。
增加的神经元活动触发突触前 caspase-3 的局部激活
研究人员首先构建了神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞的共培养体系，为研究突触 caspase-3 的激活创造了良好的模拟环境。为了探究神经元活动增加是否会引发突触前 caspase-3 的激活，他们利用 hM3Dq（一种由设计药物激活的受体），通过给予氯氮平 - N - 氧化物（CNO）来增加神经元活动。结果发现，CNO 处理后，突触前线粒体数量增加，同时免疫染色显示突触前切割的 caspase-3（激活的 caspase-3 标记）信号显著增强，且这种增加可被 caspase-3 抑制剂 Z-DEVD-FMK 阻断。此外，与突触前相比，神经元胞体和轴突的切割 caspase-3 信号较低，表明这是一种非凋亡性 caspase-3 激活。
为了实时监测 caspase-3 的激活，研究人员开发了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的新型探针 mSCAT3。将其与突触小泡蛋白（synaptophysin）融合后，通过检测 mECFP/mVenus 比率的变化来反映 caspase-3 的激活情况。实验表明，该探针能灵敏地检测到 caspase-3 的激活。在给予 CNO 后，表达 hM3Dq 的神经元特定突触前的 mECFP/mVenus 比率明显增加，进一步证实了神经元活动增加可触发突触前 caspase-3 的激活。
研究人员还发现，抑制线粒体细胞色素 c 的释放和 caspase-9 的激活（分别使用 Bax 通道阻滞剂和 NS3694），能够抑制 CNO 诱导的突触前 caspase-3 激活，且线粒体积累与突触前 caspase-3 活性呈正相关。这表明增加的神经元活动可能通过线粒体积累、细胞色素 c 释放和 caspase-9 激活来触发突触前 caspase-3 的激活。
突触前 caspase-3 激活增强补体依赖性小胶质细胞突触吞噬
以往研究表明，C1q（补体系统的重要组成部分）更倾向于与含有切割 caspase-3 的突触体共定位，且 C1q 标记突触可引发补体级联反应，进而诱导小胶质细胞的突触吞噬。为了探究突触前 caspase-3 激活对 C1q 标记和小胶质细胞突触吞噬的影响，研究人员激活神经元的 hM3Dq，并应用荧光标记的小鼠重组 C1qA（C1q 的主要成分）。结果发现，CNO 处理后，C1qA-647 在突触前的定位显著增加，而当同时使用 caspase-3 抑制剂 Z-DEVD-FMK 时，这种增加被抑制，表明突触前 caspase-3 激活促进了补体标记。
进一步研究发现，增加的神经元活动会促进突触膜上磷脂酰丝氨酸（PS）的暴露，且这种暴露可被 Z-DEVD-FMK 逆转，提示 PS 暴露可能是将 C1q 标记限制在特定突触的潜在机制。
在探究 caspase-3 激活对小胶质细胞突触吞噬的影响时，研究人员通过活细胞成像观察到，hM3Dq 激活后，补体依赖性突触吞噬增强，且这种增强可被 Z-DEVD-FMK 抑制。此外，他们还发现小胶质细胞能够选择性地吞噬突触前成分，而不剪切轴突，且这种突触选择性吞噬仅在 hM3Dq 激活且存在补体的情况下显著增加。
研究人员还利用 hM4Di（一种抑制性 DREADD）降低神经元活动，发现虽然突触 caspase 活性没有显著降低，但小胶质细胞的突触吞噬减少，这表明 caspase 依赖性突触吞噬可能作用于高活性突触，以平衡兴奋性 / 抑制性突触，维持神经回路的稳态重塑。
光遗传学诱导的突触前 caspase-3 激活引发补体依赖性突触吞噬
为了进一步明确突触前 caspase-3 激活在增强突触前补体标记和小胶质细胞吞噬中的作用，研究人员采用光遗传学方法。他们使用 opto-casp9_AtCRY2-PHR-casp9（CRY2-casp9）系统，通过蓝光照射激活 caspase-9，进而激活下游的 caspase-3。结果发现，激活 caspase-9 和 caspase-3 不仅发生在受刺激的突触前，还出现在同一轴突的近端突触前。
在给予 C1qA 并刺激突触前用蓝光照射后，免疫染色显示 CRY2-casp9 激活显著增加了突触前 C1qA 的信号，且这种增加可被 caspase-9 抑制剂 Z-LEHD-FMK TFA 逆转，表明突触前 caspase-3 激活足以引发补体标记。
通过活细胞成像和免疫染色，研究人员观察到在给予 C1qA 和蓝光刺激后，小胶质细胞选择性地吞噬突触前，且在吞噬部位 C3 受体（CR3）的荧光强度显著增加，表明 caspase-3 激活的突触前发生了补体依赖性吞噬。此外，光激活 CRY2-casp9 单独即可诱导突触吞噬，添加 C1qA 可进一步加速这一过程。
热性惊厥（FS）后局部 caspase-3 激活促进抑制性突触的补体标记
研究人员利用热性惊厥（FS）小鼠模型，探究非凋亡性 caspase-3 激活促进的突触吞噬对神经回路重塑的影响。在 FS 模型中，海马齿状回的颗粒细胞是癫痫发作的焦点。研究人员发现，FS 后，兴奋性神经元（Reelin 阳性细胞）中 c-Fos 阳性细胞密度在 1 小时后显著增加，3 小时后恢复正常；而抑制性神经元（GAD67 阳性细胞）中 c-Fos 阳性细胞密度在至少 4 小时内持续上升。
6 小时后，FS 小鼠的抑制性突触前切割 caspase-3 免疫染色信号显著增加，同时 C1q 和 C3 的表达水平也增加，且抑制性突触与 C1q、C3 和外化 PS 的共定位显著增加。而在癫痫发作诱导前 15 分钟给予 caspase-3 抑制剂 Z-DEVD-FMK，可将这种共定位降低至基线水平，且该抑制剂不影响 FS 的诱导。这表明 FS 后，caspase-3 激活通过 PS 暴露促进了抑制性突触前的补体标记。
FS 后，小胶质细胞以补体依赖的方式吞噬抑制性突触
FS 后抑制性突触的补体标记显著增加，促使研究人员进一步研究小胶质细胞的突触吞噬。他们发现，FS 后 6 小时，小胶质细胞中 CR3 的 mRNA 和蛋白表达增加，且小胶质细胞与切割 caspase-3 阳性的抑制性突触相互作用增强。免疫组化分析显示，FS 后抑制性突触的吞噬增加，而抑制性突触后和兴奋性突触的吞噬保持稳定，且只有抑制性突触的密度在 24 小时和 72 小时后下降。在 CR3 基因敲除小鼠中，FS 后抑制性突触的吞噬增加和密度降低现象消失，表明这种小胶质细胞的突触吞噬是补体依赖的。
研究人员还发现，FS 后 3 天，给予海人酸（kainic acid）诱导急性癫痫发作，有 FS 病史的小鼠癫痫评分显著更高，表明神经回路兴奋性增加；而在 CR3 基因敲除小鼠中，这种增加被抑制。由于 FS 后未观察到明显的抑制性神经元死亡，这表明 FS 后 24 小时抑制性突触的减少是神经回路兴奋性增加的基础。
研究表明，非凋亡性 caspase-3 在突触修剪和神经回路重塑中起着关键作用。增加的神经元活动可触发突触前 caspase-3 的非凋亡性激活，进而促进补体标记和小胶质细胞的突触吞噬。在热性惊厥小鼠模型中，caspase-3 激活导致抑制性突触的补体标记和小胶质细胞吞噬增加，最终影响神经回路的兴奋性。
然而，目前仍有一些问题有待解决。例如，caspase-3 激活促进突触补体标记的具体机制尚不清楚，虽然有研究表明 PS 暴露可能是其中一个环节，但其他潜在机制仍需进一步探索。此外，在不同的生理和病理条件下，如大脑发育和神经退行性疾病中，这种机制的作用是否相同，也需要更多的研究来验证。尽管如此，该研究为我们理解神经回路的发育和功能提供了重要的线索，为未来开发针对神经发育和神经退行性疾病的治疗策略奠定了基础。
