CRISPR-Cas9体内筛选揭示亨廷顿病CAG重复不稳定的新型遗传修饰因子及其治疗潜力

本研究针对亨廷顿病（Huntington's disease, HD）中驱动疾病进展的关键因素——体细胞HTT基因CAG重复扩展现象，通过创新性构建CRISPR-Cas9体内筛选平台，系统性鉴定了包括DNA错配修复（MMR）通路成员（MSH2/MSH3/MLH1/MLH3）、DNA聚合酶δ（POLδ）亚基及GWAS来源的疾病修饰基因（PMS1/PMS2）等新型调控因子，揭示了PMS1-MutLβ与MLH3-MutLγ在促进重复扩展中的非冗余功能，并首次发现FAN1-PMS2-MSH6的复杂调控网络，为开发靶向体细胞突变积累的疾病修饰疗法提供了全新靶点。

　　

亨廷顿病作为典型的动态突变疾病，其发病机制与HTT基因中CAG三核苷酸重复序列的异常扩展密切相关。令人惊讶的是，这种重复序列在个体出生后仍会在特定组织（尤其是大脑纹状体）中持续积累，且扩展程度与疾病发病年龄直接相关。尽管已知DNA修复通路（特别是错配修复系统）参与调控这一过程，但传统基因敲除小鼠模型构建周期长、通量低，难以系统揭示复杂调控网络。更关键的是，不同DNA修复因子在体细胞突变中的相对贡献、组织特异性调控机制及其相互作用仍存在巨大知识空白，严重阻碍了靶向干预策略的开发。

为突破这些技术瓶颈，来自美国麻省总医院（Massachusetts General Hospital）和哈佛医学院的研究团队创新性地将CRISPR-Cas9基因编辑技术与AAV递送系统相结合，在亨廷顿病Htt^Q111 knock-in小鼠模型中建立了首个体内大规模遗传筛选平台。该研究通过系统性靶向134个候选基因（涵盖GWAS发现的疾病修饰位点、DNA修复通路成员及染色质调控因子），不仅验证了已知强效修饰因子（如MSH2/MSH3/MLH1/MLH3），更发现了POLδ亚基（POLD1/POLD2/POLD3/POLD4）作为促进重复扩展的核心机器，以及PMS1/PMS2这对功能相反的MutL复合物成员——前者通过未知机制增强扩展，后者则与FAN1协同抑制突变积累。

研究主要采用四大关键技术：

1. 构建Htt^Q111-Cas9双转基因小鼠模型，实现组织特异性基因编辑；

2. 优化AAV8（肝脏靶向）和PHP.eB（血脑屏障穿透型）载体递送系统，实现高效sgRNA递送；

3. 开发基于毛细管电泳的CAG重复片段分析技术，定量检测体细胞突变水平；

4. 建立深度测序（NGS）编辑效率评估体系，确保基因敲除有效性。

主要研究发现

验证CRISPR编辑平台的敏感性

通过靶向已知强效修饰因子（如敲除MSH2使肝脏扩展指数降低55%，而敲除FAN1使其增加40%），证实该平台可检测到与组成型敲除相当的效应。值得注意的是，肝脏中50-60%的移码突变率即可产生完全敲除表型，提示存在双等位基因编辑优势。

新型修饰因子的发现

在GWAS候选基因中，PMS1的敲除表现出与MSH2相当的抑制效果（扩展指数降低50%），而PMS2则呈现相反效应。DNA修复通路筛选中，POLδ所有四个亚基（POLD1/POLD2/POLD3/POLD4）的敲除均显著抑制扩展，支持其通过链置换合成（strand-displacement synthesis）参与重复序列整合的假说。

脑组织特异性验证

通过PHP.eB介导的脑靶向递送，在纹状体证实了PMS1/POLD1/POLD3的促扩展作用，且效应幅度与肝脏相当（24周时扩展指数变化达35-50%），但FAN1在肝脏中的促扩展效应在脑组织中未显现，提示组织特异性调控机制。

遗传互作网络解析

双基因敲除实验揭示：FAN1的扩展抑制功能完全依赖MLH1存在；PMS2与FAN1存在功能冗余；而MSH6的缺失会削弱FAN1/PMS2的抑制效果，暗示存在未知的MSH6依赖性调控因子。

机制模型与意义

研究提出创新性"稳态失衡"模型：CAG/CTG发夹结构被MutSβ（MSH2-MSH3）识别后，优先招募具有链特异性内切酶活性的MutLγ（MLH1-MLH3），导致新生链缺口产生；POLδ随后通过链置换合成将发夹结构整合为永久性扩展。该过程受到MutLα（MLH1-PMS2）和FAN1等因子的负调控，其平衡状态决定最终扩展概率。

这项研究的意义在于：

1. 创建了可推广至其他重复扩展疾病的体内筛选范式；

2. 将GWAS关联信号转化为功能证据（如PMS1/PMS2）；

3. 揭示POLδ作为新型治疗靶点，其抑制剂可能比MMR靶向药物更安全；

4. 发现FAN1-PMS2-MSH6调控轴，为联合治疗策略提供理论基础。

论文中

展示的脑组织数据，以及

中的全基因组关联基因功能验证，共同构成了支撑这些发现的关键证据链。该成果于2025年1月22日在线发表于《Nature Genetics》，为开发延缓亨廷顿病进展的精准医学策略奠定了重要基础。