多激酶抑制剂筛选鉴定出维持干细胞样嵌合抗原受体T细胞表型的关键靶点及其抗肿瘤机制研究

为解决CAR-T细胞治疗中记忆干细胞(TSCM)表型难以维持的问题，美国北卡罗来纳大学团队通过高通量激酶抑制剂(KIs)筛选，发现UNC10225387B/263A/761A组合可特异性抑制ITK、ADCK3、MAP3K4和CDK13激酶，显著提升CD45RA+CCR7+ TSCM样细胞比例。该研究通过MIB-MS蛋白质组学、RNA-seq和ATAC-seq技术证实，该KI鸡尾酒疗法能维持TCF1hi转录特征而不影响表观遗传状态，使CAR-T细胞在淋巴瘤和神经母细胞瘤模型中展现更强的扩增能力和持久抗肿瘤效果，为优化临床CAR-T产品提供新策略。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法虽在血液肿瘤中取得突破，但临床响应持久性仍受限于T细胞终末分化导致的衰竭。尤其令人困扰的是，具有自我更新能力的T记忆干细胞(T_SCM)亚群在体外扩增过程中极易丢失，这直接影响了CAR-T细胞的体内持久性和再攻击能力。传统方法如细胞因子调控或Wnt/β-catenin通路激活虽有一定效果，但存在操作复杂或脱靶风险。更关键的是，当前对维持T_SCM表型的分子机制认知仍不完善，特别是激酶网络在这一过程中的动态调控规律亟待解析。

美国北卡罗来纳大学教堂山分校Gianpietro Dotti团队联合多个研究中心，在《Nature Immunology》发表了突破性研究。研究人员创新性地采用自动化高通量筛选平台，从810种激酶抑制剂(PKIS库)中鉴定出UNC10225387B、UNC10225263A和UNC10225761A三种抑制剂组成的"鸡尾酒"方案，能协同维持CAR-T细胞的干细胞样特性。令人振奋的是，这种多激酶靶向策略不仅显著提升了临床级CAR-T产品中CD45RA⁺CCR7⁺ TCF1^hi细胞比例，更在淋巴瘤和实体瘤模型中展现出优于常规方法的抗肿瘤活性。

研究团队运用了多项关键技术：1)建立384孔板自动化筛选系统，以CD45RA/CD45RO转化率为核心指标评估激酶抑制剂效果；2)采用MIB-MS细胞蛋白质组学分析激酶靶点结合特征；3)通过shRNA基因敲降验证关键激酶功能；4)结合RNA-seq和ATAC-seq解析转录组和染色质可及性变化；5)利用慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者来源T细胞验证临床转化潜力。

主要研究发现如下：

KIs促进源自初始T细胞的T_SCM样CAR-T细胞
通过优化给药方案(转导后第3天添加0.75μM KI组合)，CAR-T产品中CD45RA⁺CCR7⁺细胞比例提升2-3倍，且TCF7 mRNA和蛋白表达显著增加。值得注意的是，这种效应在初始T细胞(T_N)来源的CAR-T中尤为突出，提示KIs可能通过重编程分化路径而非单纯选择已存在的T_SCM群体发挥作用。

KI处理的CAR-T细胞展现卓越抗肿瘤活性
在重复肿瘤刺激实验中，KI组CAR-T扩增倍数较DMSO对照组提高5-8倍，且多细胞因子(IFNγ⁺TNFα⁺IL-2⁺)分泌细胞比例增加。小鼠模型显示，KI处理的CD19-CAR-T即使降至1×10⁶剂量仍能控制肿瘤生长，脾脏和骨髓中浸润的T_SCM样细胞显著增多。在GD2-CAR-T治疗的神经母细胞瘤模型中，该策略同样展现出跨肿瘤类型的普适性。

KI鸡尾酒靶向多重激酶网络
MIB-MS分析揭示三种抑制剂分别靶向不同激酶家族：UNC10225263A主要抑制ADCK3/CLK3/STK17B/MAP3K7；UNC10225387B靶向CDK12/MINK1/ITK/AURKA；UNC10225761A作用于MAP3K4/ADCK1/CDK13/JAK3。值得注意的是，虽然ZAP70是三者共同靶点，但shRNA实验证实仅ITK、ADCK3、MAP3K4和CDK13的联合抑制能重现KI组合的表型调控效果。

KIs引发转录组而非表观遗传改变
RNA-seq分析显示KI处理早期(24-72小时)即上调MYB、BCL6、TCF7等干细胞相关转录因子，同时抑制TBX21、PRDM1等效应基因。GSEA分析证实KI组富集OXPHOS代谢特征，这与T_SCM细胞的能量代谢特点相符。而ATAC-seq数据显示KI未引起显著的染色质重构，说明其作用是可逆的生理调节而非表观遗传重编程。

在CLL患者T细胞中验证临床价值
针对免疫功能受损的CLL患者来源T细胞，单次KI处理即可使CAR-T中T_SCM样细胞增加1.5倍，且与自体肿瘤细胞共培养时展现更强的扩增能力和IL-2分泌。动物实验进一步证实，这种优化能克服CLL微环境导致的T细胞功能障碍。

这项研究开创性地提出"多激酶节点协同调控T_SCM维持"的新范式，突破传统单靶点抑制的局限性。其临床意义在于：1)提供可无缝整合到现有GMP生产流程的简单干预方案；2)揭示ITK-ADCK3-MAP3K4-CDK13激酶轴作为记忆T细胞调控的新靶标；3)证实短暂药理学干预即可获得持久疗效，避免基因编辑的不可逆风险。特别值得关注的是，该策略对功能受损的患者来源T细胞仍有效，为改善实体瘤CAR-T疗效提供了新思路。未来研究可进一步探索这些激酶在T细胞命运决定中的时空调控机制，以及与其他记忆形成通路(如Wnt/IL-15)的协同作用。