磷酸戊糖途径通过调控氧化蛋白折叠和抑制铁死亡维持软骨细胞稳态

本研究揭示了在低氧环境下生长的软骨细胞中，磷酸戊糖途径(PPP)通过产生NADPH维持谷胱甘肽(GSH)循环，从而清除内质网中氧化蛋白折叠产生的活性氧(ROS)，保障蛋白质稳态并防止铁死亡。比利时鲁汶大学(VIB-KU Leuven)的研究团队通过单细胞RNA测序和条件性基因敲除小鼠模型，发现葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)缺失会导致NADPH不足、GSH循环障碍，进而引发未折叠蛋白反应(UPR)激活和铁死亡，最终导致软骨发育不良。该研究为理解骨骼发育和修复过程中的代谢调控机制提供了新见解，论文发表于《Nature Metabolism》。

　　

在骨骼发育过程中，生长板软骨细胞需要在缺氧的血管稀少环境中完成增殖、分化和细胞外基质合成等重要生物学过程。这种独特的微环境给细胞代谢带来了巨大挑战：既要维持足够的生物合成能力，又要应对缺氧导致的氧化应激。虽然已知软骨细胞主要依赖糖酵解供能，但关于其如何协调生物合成与氧化还原平衡的机制仍不清楚。特别是对于大量分泌胶原蛋白的软骨细胞而言，内质网中氧化蛋白折叠过程会产生大量活性氧(ROS)，这些ROS如何被及时清除以避免细胞损伤，一直是领域内悬而未决的关键科学问题。

比利时鲁汶大学(VIB-KU Leuven)的Shauni Loopmans等研究人员在《Nature Metabolism》发表的研究，首次揭示了磷酸戊糖途径(Pentose Phosphate Pathway, PPP)通过产生NADPH维持谷胱甘肽(GSH)循环，从而清除内质网中氧化蛋白折叠产生的ROS，保障蛋白质稳态并防止铁死亡(Ferroptosis)的重要机制。这项研究不仅阐明了软骨细胞在缺氧环境下的独特代谢适应机制，也为理解骨骼发育异常疾病的发病机理提供了新视角。

研究人员主要采用了四种关键技术方法：1)对新生小鼠生长板进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析代谢通路动态变化；2)构建软骨细胞特异性G6PDH敲除小鼠模型；3)使用[1,2]-¹³C₂-葡萄糖示踪技术解析PPP通量；4)结合多种流式细胞术检测氧化应激、蛋白折叠状态和细胞死亡等指标。

scRNA-seq揭示PPP在生长板中的动态调控

通过对出生3天小鼠生长板的单细胞转录组分析，研究人员发现PPP相关基因在软骨细胞分化过程中呈现动态变化模式。特别是编码PPP限速酶G6PDH的基因在静止区和肥大区高表达。免疫组化进一步证实G6PDH蛋白在生长板中的区域性分布特征。[1,2]-¹³C₂-葡萄糖示踪实验显示，增殖和分化状态的软骨细胞都通过氧化PPP代谢葡萄糖。

G6PDH决定软骨细胞存活而非增殖

研究人员构建了Col2-Cre;G6pdh^fl/fl条件性敲除小鼠(G6pdh^chon-)，发现虽然小鼠体型减小、生长板结构紊乱，但软骨细胞增殖不受影响。代谢流分析表明，敲除细胞通过逆转非氧化PPP生成足够的核糖-5-磷酸维持增殖。然而，分化期的缺氧条件导致敲除细胞死亡增加，提示PPP主要功能是维持分化期细胞存活。

G6PDH调控NADPH介导的谷胱甘肽循环

代谢组学分析显示，G6PDH缺失导致NADPH水平和NADPH:NADP⁺比值下降，伴随氧化型谷胱甘肽(GSSG)积累和GSH:GSSG比值降低。在分化期缺氧条件下，敲除细胞的H₂O₂水平显著升高，表明NADPH不足损害了ROS清除能力。

G6PDH生成的NADPH调控氧化蛋白折叠

TPE-MI流式检测发现，G6PDH缺失导致分化期软骨细胞游离巯基增加，提示二硫键形成减少。Western blot显示蛋白二硫键异构酶(PDI)的氧化还原状态发生改变。这些变化引发未折叠蛋白反应(UPR)激活和蛋白质降解途径上调，包括泛素-蛋白酶体系统和溶酶体途径。

G6PDH通过PDI维持胶原特性

G6PDH缺失导致胶原羟脯氨酸含量降低，基质金属蛋白酶(MMP)敏感性增加，表明PDI功能受损影响了胶原交联和基质稳定性。Safranin O染色显示突变体小鼠初级海绵区软骨基质残留减少，证实基质性质改变。

软骨细胞G6PDH防止铁死亡

单细胞转录组分析发现铁死亡通路在G6PDH缺失的肥大软骨细胞中显著激活。实验证实敲除细胞脂质过氧化水平升高，铁死亡标志基因Ptgs2表达上调。补充GSH乙酯或N-乙酰半胱氨酸(NAC)可逆转这些表型，证实GSH循环障碍是铁死亡的诱因。

这项研究系统阐明了PPP在软骨细胞中的双重作用：非氧化分支支持增殖所需的核苷酸合成，而氧化分支产生的NADPH则通过维持GSH循环来保障氧化蛋白折叠和细胞存活。这一发现不仅揭示了骨骼发育的代谢调控新机制，也为理解其他高分泌活性细胞在缺氧条件下的适应性策略提供了重要参考。从转化医学角度看，该研究为软骨发育不良等骨骼疾病的治疗提供了潜在靶点，也为组织工程中改善软骨细胞存活提供了新思路。