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在单细胞蛋白质组学（SCP）面临深度和定量性能局限的情况下，研究人员借助 Thermo Scientific Orbitrap Astral 质谱仪展开研究。他们提升了蛋白质组覆盖深度、定量准确性与精密度，成果有助于揭示细胞异质性，推动生命科学发展。
在生命科学的微观世界里，细胞如同一个个神秘的小宇宙，蕴含着无尽的奥秘。单细胞蛋白质组学（SCP）作为探索细胞微观世界的有力工具，近年来备受关注。然而，尽管在样本制备、仪器设备和数据分析等方面取得了显著进展，SCP 仍面临着蛋白质组深度和定量性能的限制。这就好比我们拿着一张分辨率有限的地图，难以精确地描绘出细胞内蛋白质的复杂 “地貌”。在研究细胞的过程中，我们迫切需要更清晰、更准确地了解细胞内蛋白质的种类和数量，以揭示细胞的功能和特性，以及它们在疾病发生发展中的作用。
为了解决这些问题，来自奥地利维也纳生物中心分子病理学研究所（IMP）等多个机构的研究人员 Julia A. Bubis、Tabiwang N. Arrey、Eugen Damoc 等开展了一项重要研究。他们利用 Thermo Scientific Orbitrap Astral 质谱仪，结合一系列优化的实验条件和数据分析方法，对单细胞蛋白质组学进行了深入探究。该研究成果发表在《Nature Methods》上，为单细胞蛋白质组学领域带来了新的突破。
在研究方法上，研究人员主要运用了以下关键技术：首先，使用 Thermo Scientific Orbitrap Astral 质谱仪与 Aurora Ultimate TS 25-cm nanoflow 超高效液相色谱（UHPLC）柱联用，以提高检测的灵敏度和分辨率；其次，通过优化梯度长度，确定了最佳的样本处理通量；再者，利用定制的文库进行蛋白质组覆盖深度的提升；最后，运用数据非依赖性采集（DIA）技术和 Spectronaut 软件进行数据分析，确保数据的准确性和可靠性。在样本方面，研究人员使用了 HeLa、K562、A549 等细胞系，以及人胚胎干细胞（hPS）和滋养外胚层（TE）样细胞。
下面来看看具体的研究结果：
- 达到前所未有的蛋白质组覆盖深度：研究人员将 Orbitrap Astral 质谱仪与多种技术相结合，以 250 pg 的 HeLa 和 K562 细胞肽为样本进行实验。通过优化梯度长度，发现 50 样本 / 天（SPD）的通量能实现最大的蛋白质组覆盖，此时每个洗脱峰平均有五个数据点，足以进行准确的定量分析。此外，使用定制文库进一步提高了蛋白质组覆盖深度，从仅 250 pg 的 HeLa 细胞肽输入中，一次运行就能鉴定出超过 7,500 种蛋白质。
- FDR 策略的验证：为了评估数据的准确性，研究人员生成了混洗目标数据库和秀丽隐杆线虫数据库进行 FDR 估计。结果发现，Spectronaut 18 版本的默认设置过于宽松，导致 FDR 略高于预期。应用更严格的截止值后，虽然蛋白质数量略有下降，但能更准确地反映真实的 FDR。
- FAIMS Pro 接口改善信噪比、CV 和覆盖度：研究人员对 FAIMS Pro 接口的最佳补偿电压进行筛选，发现使用该接口在最佳设置下，能显著提高信噪比，增加低丰度前体 / 蛋白质的鉴定数量，同时降低 CV，提高数据质量。
- 定量性能评估：通过比较两种不同人 - 酵母混合比例的蛋白质组，研究人员评估了工作流程的定量性能。结果表明，Orbitrap Astral 质谱仪在定量准确性和精密度方面表现出色，尤其是在检测低丰度蛋白质时，优于 Orbitrap Exploris 480 质谱仪。
- 单细胞的原理验证研究：
- 两种人类非小细胞肺癌模型的异质性：研究人员应用优化的工作流程对 A549 和 H460 细胞进行分析，发现两种细胞系的蛋白质含量存在差异，且该方法能够根据蛋白质丰度谱清晰区分两种细胞系和空白对照，证明了其研究细胞异质性的能力。
- A549 细胞大小与细胞周期的相关性：对不同大小的 A549 细胞进行分析，发现鉴定出的蛋白质组数量与细胞大小相关，且通过主成分分析（PCA）和 UMAP 分析，发现细胞根据直径不同而聚类，这可能与细胞周期阶段有关。
- 人类 hPS 细胞和 TE 样衍生物的表征：对 hPS 细胞和 TE 样细胞进行分析，通过 PCA 和 UMAP 聚类分析，发现两种细胞群体明显分离。GO 分析表明，TE 样细胞中上调的蛋白质在细胞骨架组织等生物学过程中富集，且能鉴定出一些转录因子和细胞标记蛋白，其丰度与转录组数据相关。
- 与假批量数据（100 个细胞）的比较：将单细胞数据集与假批量数据进行比较，发现 PCA 能区分不同细胞类型，但假批量数据在 GO 分析中显示出更多生物学相关途径，不过两种数据在某些途径上的蛋白质数量相似，只是假批量数据的 P 值更低。
研究结论和讨论部分指出，尽管在超低输入蛋白质组学领域取得了一定进展，但同时实现高样本通量、可重复性、定量准确性、精密度和高灵敏度仍然具有挑战性。本研究的工作流程通过多种技术的结合，在一定程度上满足了这些标准。Orbitrap Astral 质谱仪在定量蛋白质数量、灵敏度和定量准确性方面优于 Orbitrap Exploris 480 质谱仪，能够基于细胞大小和细胞周期阶段研究未处理培养细胞的异质性，还能区分 TE 样细胞和 naive hPS 细胞，这对于探索 TE 发育机制、囊胚形态调节和识别高质量囊胚的分子标记具有重要意义，有助于我们更好地理解人类囊胚发育，提高体外受精成功率。此外，该研究优化的工作流程从样本制备到数据解释，为单细胞蛋白质组学在灵敏度、可重复性和定量性能方面的进一步发展做出了重要贡献，有望推动该领域从发展阶段进入生物学家的实用工具阶段。
