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本文介绍了一种高灵敏度单细胞蛋白质组学（SCP）工作流程 Chip-Tip，能在单个 HeLa 细胞中鉴定出超 5000 种蛋白质，还可直接检测单细胞的翻译后修饰（PTM）。该技术提高了 SCP 的灵敏度和通量，在基础生物学和生物医学研究中具有重要应用价值。
单细胞蛋白质组学研究背景
多细胞生物由多种细胞类型组成，每种细胞执行独特功能。单细胞 RNA 测序虽为细胞生物学研究带来变革，但信使 RNA（mRNA）不能直接反映细胞活动。蛋白质分析能更直接、全面地理解细胞功能、调控机制和疾病过程，可捕捉 mRNA 分析无法体现的翻译后修饰（PTMs）、蛋白质多样性和功能信息。
单细胞蛋白质组学（SCP）成为蛋白质组学新前沿，有助于深入了解细胞分化和疾病，可用于描绘细胞群体功能表型、阐释细胞和胚胎发育、预测疾病发展轨迹、确定细胞特异性表面标记和潜在治疗靶点。然而，SCP 尚处于发展初期，面临序列深度、通量和可重复性等挑战，限制了其广泛应用。
Chip-Tip 工作流程的建立
SCP 主要采用无标记（label-free）或多重分析（multiplexed analysis）两种定量技术。无标记定量（LFQ）分析是最简单的 SCP 工作流程，但在样品制备和分析过程中，肽段易因蛋白质吸附损失、化学修饰和离子操作而丢失。为解决这些问题，研究人员开发了基于近乎无损 LFQ 的 SCP 方法 Chip-Tip。
Chip-Tip 工作流程包括使用 cellenONE 和 proteoCHIP EVO 96 进行单细胞分配和样品制备，直接转移到 Evotip 处理捕集柱，随后使用 Evosep One LC 和 Whisper 流梯度，结合 Orbitrap Astral 质谱仪上的窄窗口数据独立采集（nDIA）进行分析。研究人员系统评估了数据库搜索工具，并采用捕获方法估计错误率，以确保数据分析可靠。
Chip-Tip 工作流程的优化与性能评估
- 高灵敏度与高通量实现：SCP 样品制备需考虑减少表面吸附损失、降低缓冲液蒸发和移液步骤以提高重现性、最大化检测灵敏度。Chip-Tip 工作流程旨在实现超高灵敏度，细胞经分离后在 cellenONE X1 平台采用一锅法技术处理。proteoCHIP EVO 96 专为单细胞样品制备设计，可在纳升水平最小化体积，同时并行处理多达 96 个细胞的蛋白质组学样品。结合 Evosep One LC 系统的 Whisper 流方法和高精度 IonOpticks nanoUHPLC 柱，以及 nDIA 方法在 Orbitrap Astral 质谱仪上的应用，极大提高了 SCP 分析的灵敏度和效率。
优化 nDIA 方法时发现，使用 4-Th DIA 窗口和 6-ms 最大注入时间（4Th6ms）可获得最高蛋白质组覆盖率。在单个 HeLa 细胞中，中位数为 5204 种蛋白质被鉴定出来，在一批仅 20 个细胞的样本中，鉴定出超过 7000 种蛋白质。肽段水平的深度也很显著，单细胞样本中位数为 41700 个肽段，20 细胞样本为 98054 个肽段，单细胞蛋白质序列覆盖率中位数为 12.9%，20 细胞样本为 25%。基于强度的绝对定量（iBAQ）值显示出广泛的动态范围，相对蛋白质丰度估计在不同细胞数量的样本中呈现近似线性关系。该方法还能鉴定出所有亚细胞定位的蛋白质，在质膜上鉴定出超 200 种蛋白质，体现了其稳健性。
- 载体蛋白质组效应研究：在基于 LFQ 的 SCP 中，光谱与数据库匹配策略会影响单细胞蛋白质组学分析结果。研究人员对 Spectronaut 和 DIA-NN 两种常用的 DIA 数据库搜索工具及其搜索策略进行系统评估，以阐明 “载体蛋白质组” 对 SCP 的影响。结果表明，与仅搜索单细胞样本相比，纳入载体蛋白质组可显著增加鉴定数量。在 Spectronaut 中，随着搜索的单细胞文件数量增加，鉴定数量也逐渐上升。分析不同搜索策略鉴定出的蛋白质丰度发现，纳入更多细胞的搜索可识别出更低丰度的蛋白质，载体蛋白质组能使鉴定低丰度蛋白质成为可能。对比 DIA-NN 和 Spectronaut 在不同细胞样本中的鉴定结果，发现两者有较大重叠，但 Spectronaut 中两个单细胞样本蛋白质定量相关性（R = 0.91）略高于 DIA-NN（R = 0.89），而同一单细胞样本在 Spectronaut 和 DIA-NN 中的相关性（R = 0.83）相对较低。
为评估鉴定结果的可信度，研究人员采用捕获数据库搜索策略，使用 Spectronaut 和 DIA-NN 进行错误发现率（FDR）基准测试。在蛋白质水平默认 FDR 参数设置为 0.01 的情况下，结合 20 细胞样本作为载体蛋白质组分析单细胞样本，经校正后，Spectronaut 中蛋白质水平的经验 FDR 约为 3%，DIA-NN 中约为 1%。
- 提升 SCP 性能的其他策略：质谱（MS）通量限制是无标记 SCP 的主要瓶颈，研究人员创新地采用 Whisper Zoom 方法，将 Evosep One LC 系统的通量从每天 40 个样本（SPD）提高到 80SPD 甚至 120SPD。该优化的液相色谱（LC）方法不仅提高了通量，还增强了色谱性能并保持高灵敏度，在 80SPD 和 120SPD 方法下，单个 HeLa 细胞中可鉴定出超 4500 种蛋白质。通过注入不含单细胞的空白样本测试整个工作流程的污染和残留情况，结果显示空白样本蛋白质鉴定数量极少，证明了工作流程的稳健性和低污染风险。
研究人员还评估了另一种使用 Vanquish Neo LC 和配备前端高场不对称波形离子迁移谱（FAIMS）接口的 Orbitrap Astral 的设置。使用单补偿电压 - 48 V，FAIMS Pro Duo 接口进一步提高了分析性能，单个 HeLa 细胞中鉴定出超 6500 种蛋白质。尽管该 96 孔板格式制备和直接注入 LC-MS 系统没有样品净化步骤，但空白样本也显示无污染性能。
- 无需富集的 PTM 深度分析：Chip-Tip 在肽前体水平的高覆盖度不仅有助于蛋白质鉴定和定量，还可能揭示 PTM 信息。由于 PTM 的亚化学计量性质，传统 LC-MS/MS 分析通常需要在质谱分析前对含 PTM 的肽段进行特异性富集。但基于 Chip-Tip 在 SCP 中实现的高肽段覆盖度，研究人员推测无需特异性富集也可能鉴定 PTM。
研究人员以磷酸化和糖基化这两种重要的 PTM 为例进行研究。在单细胞中定量了 168 种蛋白激酶，涵盖所有主要激酶家族。以 20 细胞样本为载体蛋白质组，在单细胞样本中搜索丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化作为可变修饰，虽未进行细胞扰动或样品处理以保留磷酸化位点，但仍自信地鉴定出中位数为 120 个磷酸丝氨酸（phospho-Ser）、28 个磷酸苏氨酸（phospho-Thr）和 13 个磷酸酪氨酸（phospho-Tyr）位点，且位点定位概率较高。平均鉴定出 114 种磷酸化蛋白质，主要参与核小体组装和组织。序列 logo 分析突出了常见的磷酸化基序，如与 CDK 等丰富激酶底物对应的脯氨酸导向的 SP 基序。通过提取离子色谱图（XIC）筛选磷酸酪氨酸的质量缺陷亚胺离子，在整个 LC 洗脱曲线中显示出强烈信号。
在蛋白质糖基化研究方面，检测到所有糖基化途径中的多种糖基转移酶。采用类似磷酸酪氨酸亚胺离子筛选的策略，对常见聚糖进行氧鎓离子筛选，发现所有聚糖在大多数 MS2 光谱中都大量存在，即使使用 nDIA 也是如此。亚胺离子和氧鎓离子的筛选表明，蛋白质磷酸化和糖基化等 PTM 在单细胞中普遍存在，但由于当前数据库搜索算法的限制，精确鉴定修饰肽段仍具有挑战性。
- Chip-Tip 在肿瘤研究中的应用 —— 以 5-FU 处理的球体分析为例：为展示 Chip-Tip 在 80SPD 下的适用性，研究人员研究了化疗药物 5 - 氟尿嘧啶（5-FU）对结直肠癌细胞球体的影响。用新开发的解离缓冲液处理 20 分钟后，5-FU 处理的球体随时间推移解体增加，而对照球体保持紧密结构，表明 5-FU 对细胞凝聚力有影响。
采用 80SPD 方法进行单细胞分析后，共鉴定出超 2500 种蛋白质。5-FU 的激活途径显示 TYMP 略有上调，这对将 5-FU 转化为其 DNA 整合活性形式至关重要，是药物疗效的关键指标。基因本体（GO）术语的层次聚类突出了受 5-FU 作用机制影响的生物过程，如环化酶细胞质活性和核糖嘌呤合成，5-FU 主要作用于核糖体 RNA（rRNA）合成，核糖体以及嘌呤和 / 或嘧啶合成是其主要靶点。UpSet 图进一步剖析了 5-FU 的作用，详细说明了哪些过程受治疗影响最大及其调节趋势。与这些 GO 术语相关的蛋白质变化突出了特定蛋白质，如 ADCY 有助于焦磷酸盐形成，角蛋白对球体结构完整性和细胞凋亡阶段细丝组织变化至关重要。这些结果表明 5-FU 对球体稳定性和嘌呤代谢有靶向破坏作用，体现了该药物干扰关键细胞功能的能力。
- Chip-Tip 在干细胞研究中的应用 ——hiPSC 分化研究：由于 Chip-Tip 可在单个 HeLa 细胞中量化超 5000 种蛋白质，这种分析深度足以获取特定细胞标记信息。研究人员通过胚胎体（EB）诱导研究人诱导多能干细胞（hiPSC）向多种细胞类型的无向分化。
在干细胞研究中，某些胚胎转录因子如 OCT4 和 NANOG 翻译拷贝数极低，但对 hiPSC 的细胞身份至关重要，细胞特异性谱系标记在 hiPSC 分化时出现，且有时仅在少数细胞中存在，因此分析深度至关重要。研究人员在 hiPSC 中量化了多达 4700 种蛋白质，在 EB 的大细胞中量化了 6200 种蛋白质。主成分分析（PCA）显示 hiPSC 和 EB 之间有明显分离，部分 EB 细胞之间的距离与 EB 和 hiPSC 之间的距离相当，表明 EB 细胞之间差异较大。研究人员持续量化了 hiPSC 和部分 EB 细胞中的 OCT4，还检测到另一种干细胞标记 SOX2 在 hiPSC 中高表达，以及多种谱系标记，如内胚层的 GATA4、中胚层的 HAND1 和外胚层的 MAP2，这些标记在 EB 细胞中表达更高但变异性大，与 EB 细胞分化为三个胚层的事实相符。研究还观察到大多数 EB 细胞分化时 SBDS 蛋白丰度早期增加，这是多能干细胞早期分化的特征。OCT4 和 SOX2 在 hiPSC 中的丰度明显高于 EB 细胞。
为研究 EB 和 iPSC 之间以及不同 EB 细胞之间的全局差异，研究人员进行无监督层次聚类，突出显示六个不同的细胞簇，其中一个仅由 iPSC 组成，与 PCA 观察到的分离一致。通过方差分析（ANOVA）进行统计分析，并对显示显著差异（P < 0.05）的蛋白质进行无监督层次聚类，然后对蛋白质簇进行 GO 术语富集分析。结果显示不同细胞功能在不同细胞簇中富集，突出了每个细胞簇之间的生理差异，如 Wnt 信号、呼吸、细胞周期、DNA 复制、mRNA 和 rRNA 加工、线粒体功能、细胞粘附和迁移等方面的差异。hiPSC 在代谢、细胞周期、染色质状态和细胞外基质粘附等生物学特征上与大多数细胞不同，这些特征在 GO 富集分析中也有所体现，如 hiPSC 中参与有氧呼吸和线粒体呼吸链复合物 I 组装的蛋白质水平较低，粘附蛋白水平较低，但参与细胞周期、DNA 复制和染色质重塑的蛋白质水平较高。因此，该分析为干细胞分化的一般途径和特定低丰度生物标志物提供了有价值的生物学见解。
研究总结与展望
本研究在 SCP 领域取得重大进展，灵敏度大幅提高，蛋白质鉴定数量从约 2000 种增加到 5000 - 6500 种。cellenONE 近乎无损的单细胞样本制备、Evosep One Whisper 流梯度和 Orbitrap Astral 上的 nDIA 相结合，为 SCP 提供了高覆盖度和稳健性。对软件工具的严格评估和 FDR 策略的实施增强了蛋白质鉴定的可信度，证明了 PTM 分析无需特异性富集的可行性，引入的球体特异性解离缓冲液提高了球体解离效率和蛋白质组分析的稳健性。
然而，MS 通量目前仍是主要瓶颈，最高为 120SPD。研究人员提出将 nDIA 与多重方法（如串联质量标签和多重 DIA）相结合可能缓解这一限制，有望大幅提高通量和分析深度。非 MS 技术在单个蛋白质鉴定和测序方面也取得了令人兴奋的进展，如单分子肽测序和纳米孔测序等。尽管 Chip-Tip 工作流程表现出高重现性和有效蛋白质鉴定能力，但芯片的处理体积和材料等方面可能影响灵敏度，需进一步研究。研究人员还在不同仪器上测试了 Chip-Tip 方法，证明了其在多种商业设备上的通用性和稳健性。
将 SCP 分析应用于 hiPSC 向 EB 的诱导研究，展示了该技术在解决生物学相关问题方面的强大能力。单细胞基因组学、蛋白质组学和其他组学测量的整合将成为未来研究的变革性方法，多组学实验有望更全面地理解细胞状态，尤其是在疾病背景下。
