基因工程改造的三重致死开关结核分枝杆菌株为动物模型提供可控结核感染

研究人员针对结核病疫苗研发中缺乏安全可控的人类挑战模型这一关键问题，通过基因工程技术构建了携带三重致死开关（TKS）的结核分枝杆菌（Mtb）菌株。该菌株在四环素和甲氧苄啶存在时表现与野生型相似的生长特性，而在撤除诱导剂后可被快速清除，且逃逸突变率低于10-10/基因组/代。研究证实该菌株在免疫缺陷小鼠中不会复发，为结核病人类挑战模型（CHIM）的建立提供了安全有效的候选株，将加速疫苗评估和免疫保护机制研究。

　　

结核病（TB）仍是全球最致命的传染病之一，而疫苗研发却长期陷入瓶颈。现有卡介苗（BCG）对成人肺结核保护率不足50%，新型疫苗M72/AS01_E的保护效果也远低于麻疹等传统疫苗。制约研发进程的核心难题在于缺乏能模拟人类感染的安全实验模型——既需要病原体在宿主体内有限复制以激发免疫反应，又必须确保其可被彻底清除。传统动物模型与人类免疫应答存在显著差异，而非人灵长类（NHP）研究成本高昂且预测性存疑。

哈佛大学陈曾熙公共卫生学院与威尔康奈尔医学院的研究团队在《Nature Microbiology》发表突破性成果，通过合成生物学手段构建了携带三重致死开关（triple-kill-switch, TKS）的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）工程菌株。该菌株整合了两种噬菌体溶素（L5L和D29L）和一种降解标签（ddTMP-NadE）系统：前两者受四环素类抗生素负调控，后者通过甲氧苄啶（TMP）抑制ClpC1蛋白酶对必需酶NadE的降解。这种正交设计使菌株在撤除诱导剂后能通过细胞壁溶解和代谢阻断双重途径被快速杀灭。

研究采用基因编辑、蛋白质降解系统构建、全基因组测序和跨物种感染模型等关键技术。通过ORBIT重组系统在染色体上精确插入调控元件，利用流式细胞术和显微成像定量蛋白降解动力学，采用波动实验测定逃逸突变率，并在C57BL/6小鼠、重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠和食蟹猴中验证感染可控性。

双重溶素系统的杀菌特性

构建的dual-lysin菌株在体外撤除无水四环素（aTc）后呈现每3天1个对数的杀菌速率，逃逸突变率为8.8×10^-9/基因组/代。小鼠实验中，停用强力霉素（doxy）后肺部和脾脏清除速率分别为每周0.50和0.35个对数。在食蟹猴模型中，持续6周给药组形成典型肉芽肿病变，而2周给药组除个别动物外均实现器官灭菌，证实溶素系统的时空可控性。

TMP依赖的蛋白降解机制

将不稳定降解标签ddTMP与NAD合成酶NadE融合后，该蛋白在无TMP时半衰期仅1小时。3 ng/ml TMP即可支持细菌生长，而撤药后2天内导致2个对数的活菌下降。全基因组测序显示逃逸突变主要发生在降解标签区域，突变率为5.1×10^-9/基因组/代，证实杀伤作用源自靶向蛋白降解而非脱靶效应。

三重开关协同效应

TKS菌株在含aTc和TMP的培养基中生长曲线与野生型H37Rv重叠，对异烟肼（INH）、利福平（RIF）等一线药物敏感性相同。但在双重限制条件下，杀菌速率提升至每周3个对数，11天内实现完全灭菌。关键的是，三种开关同时失活的逃逸率低于检测限（<3.8×10^-10），理论计算值更达10^-15量级。

动物模型中的可控性验证

C57BL/6小鼠停用诱导剂后，肺部细菌以每周0.75个对数的速率清除，84天后CD4⁺和CD8⁺T细胞应答恢复至基线水平。在SCID和Rag^-/-小鼠中，即使重新提供诱导剂10周也未观察到复发，且骨髓、淋巴结等多器官培养均为阴性。

该研究首次实现结核分枝杆菌感染的可编程控制，其创新性体现在：①通过正交调控避免交叉干扰，使逃逸突变率低于现有安全标准；②整合表型杀伤（溶素）和代谢阻断（蛋白降解）双重机制；③在免疫健全和缺陷模型中均证实无残留风险。作为首个符合伦理要求的结核病人类挑战模型候选株，TKS菌株将革新疫苗效价评估体系，并为研究早期免疫应答提供标准化平台。未来需在非人灵长类中进一步验证安全剂量，并开发无创性菌载监测技术以推动临床转化。