全基因组测序完善林奇综合征分子遗传检测流程：非编码变异与复杂结构变异的系统性解析

编辑推荐：针对多基因 panel 检测(MGPT)无法识别非编码致病变异(PVs)的临床难题，匈牙利国家肿瘤研究所团队建立DNA-RNA-肿瘤组织多组学整合的WGS优先检测流程。在100例疑似林奇综合征(LS)患者中，发现28个简单PVs和3个复杂PVs，并通过WGS检出MLH1深内含子变异(c.306+1222 A>G)。该研究首次证实复杂PVs与深内含子变异在匈牙利人群中的复发性，为LS分子诊断提供标准化解决方案。

　　

在遗传性肿瘤领域，林奇综合征(LS)作为最常见的癌症易感综合征之一，其分子诊断始终面临"缺失遗传性"的挑战。尽管多基因 panel 检测(MGPT)已能高效识别MLH1、MSH2等错配修复(MMR)基因的编码区变异，但约20-25%的MSH2/PMS2致病变异和大量非编码变异仍可能被漏检。更棘手的是，复杂结构变异(SVs)的验证需要多技术平台协同，而深内含子变异只能通过全基因组测序(WGS)等补充方法检测。这些诊断缺口导致部分符合临床标准的患者无法获得明确遗传学解释，进而影响其家族成员的预防管理。

匈牙利国家肿瘤研究所分子遗传学系的Klaudia Horti-Oravecz等研究者开展了一项前瞻性研究，旨在建立标准化WGS优先检测流程。团队连续纳入100例符合NCCN指南的结直肠癌(CRC)/子宫内膜癌(EC)患者，通过免疫组化(IHC)、MLH1启动子甲基化检测、等位基因失衡分析等多组学方法筛选WGS候选样本。研究不仅验证了复杂PVs的转录效应，更首次发现MLH1深内含子变异c.306+1222 A>G在匈牙利人群中的复发性特征。该成果为LS的完整分子诊断提供了可推广的解决方案，相关论文发表于《npj Genomic Medicine》。

关键技术方法包括：1)采用TruSight Hereditary Cancer Panel进行MGPT检测；2)通过MLPA和长片段PCR验证拷贝数变异(CNVs)；3)基于焦磷酸测序的MLH1启动子16个CpG位点甲基化分析；4)无义介导的mRNA衰变(NMD)抑制实验；5)Illumina NovaSeq 6000平台进行30-50X WGS测序，结合DRAGEN和SpliceAI等生物信息学分析。

多模态分子遗传诊断流程的建立
研究团队设计的算法创新性地将肿瘤组织分析与RNA检测相结合：对于MLH1蛋白缺失但启动子非甲基化的肿瘤，或存在MMR基因等位基因失衡的样本，优先推荐WGS检测。这种策略在保证敏感性的同时，将WGS检测率控制在1%(100例中仅1例需WGS)，大幅降低诊断成本。值得注意的是，该流程突破了传统依赖家族史筛选的局限，能有效识别新生突变(de novo PVs)病例。

MGPT识别LS基因复杂PVs
在31例阳性检出者中，患者#10的MLH1复杂SV尤为特殊。通过整合NGS数据、双探针MLPA和cDNA测序，研究者解析出该变异实为外显子18部分缺失与外显子19串联重复的嵌合体，最终命名为MLH1 c.[2078_2172del;2080_*+493dup]。患者#97的MSH2变异则呈现鸟嘌呤插入伴随5'端114bp序列重复(c.2620_2621ins[G;2507_2620])，导致移码突变p.Tyr874CysfsTer3。这些发现凸显了MGPT在复杂SV检测中的局限性，以及后续实验验证的必要性。

WGS检出MLH1深内含子PV
患者#4的肿瘤表现出MLH1/PMS2蛋白缺失但启动子非甲基化特征，且存在MLH1 c.-93G>A标记变异等位基因失衡。WGS锁定深内含子变异c.306+1222 A>G后，NMD抑制实验证实该变异激活隐蔽剪接位点，导致288bp内含子序列"外显子化"。等位特异性RT-PCR显示，异常转录本仅来自变异等位基因，而野生型转录本完全源自正常等位基因，完美解释了先前观察到的等位基因失衡现象。

复杂PVs的群体复发性
回顾性分析发现，MLH1 c.306+1222 A>G在另一例MLH1缺陷型CRC患者中重现。更引人注目的是，3例独立家族的MLH1复杂SV具有相同断点，MSH2 c.[2042 A>C;2045 C>T]复合变异也在胰腺癌患者中再现。这种群体特异性复发模式提示这些变异可能是匈牙利人群的奠基者突变(founder mutations)，对当地遗传咨询具有重要价值。

该研究通过19个月的前瞻性实践，将LS的分子诊断率从31%提升至32%。虽然绝对值增幅看似有限，但深内含子变异的检出为多个癌症高发家族提供了遗传学解释。研究建立的"MGPT初筛→甲基化/RNA分析→WGS验证"三步法，以约300美元的前期筛选成本，避免了所有患者直接进行WGS(3000-4000美元/例)的经济负担。此外，团队开发的MLH1 c.[2078_2172del;2080_*+493dup]断点特异性PCR方案，为这类复杂变异的临床检测提供了标准化工具。

值得关注的是，该研究揭示了当前遗传检测体系的局限性：即便在理想条件下，约24.8%的突变携带者家属选择级联检测，这可能导致部分变异致病性证据不足。未来需要整合表观遗传学分析(如MLH1组成型甲基化检测)和长读长测序技术，以攻克剩余诊断难题。尽管如此，这项研究仍为MMR基因全谱变异检测树立了新标准，其多组学整合策略也可推广至其他遗传性肿瘤综合征的诊断。